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  • 發布時間:2020-09-01 12:20 原文鏈接: WesternBlot操作流程

    試劑配制

    (一)母液
    1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g
    蒸餾水 200ml
    溶解后,用濃鹽酸調pH至所需點(見下所示),最后用蒸餾水定容至250ml,高溫滅菌后室溫下保存。 PH HCl
    7.4 約17ml
    7.5 約16m
    7.6 約15ml
    8.0 約10ml
    1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g
    異丙醇 100ml
    溶解后,分裝于1.5ml離心管中,-20℃保存。
    0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4(MW119.98) 12g
    蒸餾水至 500ml
    溶解后,高壓滅菌,室溫保存。
    0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO·12H2O(MW 358.14) 71.6g
    蒸餾水至 1000ml
    溶解后,高壓滅菌,室溫保存。
    10%SDS SDS 10g
    蒸餾水至 100ml
    50℃水浴下溶解,室溫保存。如在長期保存中出現沉淀,水浴溶化后,仍可使用。
    10%過硫酸胺(AP) 過硫酸胺 0.1g
    超純水 1.0ml
    溶解后,4℃保存,保存時間為1周。
    (可先將過硫酸胺干粉稱好分量后放在EP管中,一次性多裝幾管,使用時加入超純水即可)
    1.5mol/L Tris·HCl(pH8.8) Tris (MW121.14) 45.43g
    超純水 200ml
    溶解后,用濃鹽酸調pH至8.8,最后用超純水定容至250ml,室溫下保存。
    0.5mol/L Tris·HCl(pH6.8) Tris (MW121.14) 15.14g
    超純水 200ml
    溶解后,用濃鹽酸調pH至6.8,最后用超純水定容至250ml,室溫下保存。
    40%Acr/Bic(37.5:1) 丙稀酰胺(Acr) 37.5g
    甲叉雙丙稀酰胺(Bic) 1g
    超純水至 100ml
    溶解后4℃保存。使用時恢復至室溫且無沉淀。
    20%Tween20 Tween20 20ml
    蒸餾水至 100ml
    混勻后4℃保存。
    (二)使用液
    單去污劑裂解液(PMSF): 1mol/L Tris·HCl(pH8.0) 2.5ml
    NaCl 0.438g
    TritonX-100 0.5ml
    蒸餾水至 50ml
    混勻后4℃保存。使用時,加入PMSF至終濃度為100μg/ml(0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl)。
    (一般實際用的比較多的其實是RIPA裂解配方:50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脫氧膽酸鈉、0.1% SDS。至于其中每個要加多少量那就自己去算吧,因為本人已經算好的配方表無意間弄丟了)
    0.01mol/L PBS( pH 7.2-7.4) 0.2 mol/L NaH2PO 19ml
    0.2 mol/L NaHPO4 81ml
    NaCl 17g
    蒸餾水至 2000ml
    (如果用TBST進行洗膜的話,其實PBS用得很少,大可不必自己配制,向試劑公司購買20×的PBS濃縮液即可,500ml的濃縮液不到50元,很方便)
    G250考馬斯亮藍溶液(蛋白定量專用) 考馬斯亮藍G250 100mg
    95%乙醇 50ml
    磷酸 100ml
    蒸餾水至 1000ml
    配制時,先用乙醇溶解考馬斯亮藍染料,再加入磷酸和水,混勻后,用濾紙過濾,4℃保存。
    0.15 mol/L NaCl NaCl(MW58.44) 0.877g
    蒸餾水至 100 ml
    高溫滅菌后,室溫保存。
    100mg/ml 牛血清白蛋白(BSA) BSA 0.1g
    0.15 mol/L NaCl 1ml
    溶解后-20℃ 保存。制作蛋白標準曲線時,用0.15 mol/L NaCl進行100倍稀釋成1mg/ml,-20℃保存。

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