非變性聚丙烯酰胺凝膠和變性sds-page電泳在操作上基本上是相同的，只是非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制和電泳緩沖液中不能含有變性劑如SDS
等。一般蛋白進行非變性凝膠電泳要先分清是堿性還是酸性蛋白。分離堿性蛋白時候，要利用低pH凝膠系統，分離酸性蛋白時候，要利用高pH凝膠系統。酸性蛋白通常在非變性凝膠電泳中采用的pH是8.8的緩沖系統，蛋白會帶負電荷，蛋白會相陽極移動；而堿性蛋白通常電泳是在微酸性環境下進行，蛋白帶正電荷，這時候需要將陰極和陽極倒置才可以電泳。
分離酸性蛋白
工作液配制
1. 40%膠貯液(Acr:Bis=29：1）；
2. 4×分離膠Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于80ml 水，用濃HCl調pH 8.8，加水定容到100ml，4℃ 貯存；
3. 4×堆積膠Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6 g Trisbase 溶于80ml 水，用濃HCl調pH 6.8，加水定容到100ml，4℃ 貯存；
4. 10×電泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144 g 甘氨酸，加水定容到1l ，4℃ 貯存；
5. 2×溴酚藍上樣Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，0.2ml 0.5% 溴酚藍，5.5ml dH2O； -20℃貯存；
6. 10%APS；
7. 0.25%考馬斯亮藍染色液:Coomassie red R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；
8. 考馬斯亮藍脫色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O
電泳膠的配制及電泳條件（上槽電極為負，下槽電極為正）
1. 堿性非變性膠 17%分離膠(10 ml) 4%堆積膠(5 ml)
2. 40%膠貯液(40%T,3.3%C） 4.25ml 0.5ml
3. 4×分離膠Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8) 2.5ml
4. 4×堆積膠Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml
5. 水 3.2ml
6. 10%APS 35 μl
7. TEMED 15 μl
8. 10×電泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀釋到1L
電泳條件 :100V恒壓約20min，指示劑進入濃縮膠；改換160V恒壓，當指示劑移動到膠板底部時，停止電泳，整個過程約80min。
染色和脫色:取出膠板于0.25%考馬斯亮藍染色液中染色約30min，傾出染色液，加入考馬斯亮藍脫色液，緩慢搖動，注意更換脫色液，直至膠板干凈清晰背景。也可以用銀染或者活性染色。
分離堿性蛋白
要用低pH凝膠系統，并使用以下緩沖液體系：
1. 分離膠：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）；
2. 堆積膠：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）；
3. 電泳緩沖液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5
將正負電極倒置，用甲基綠（0.002%）為示蹤劑
實驗操作同分離酸性蛋白。
回收
native-PAGE結束以后，采用電泳的方法進行回收，方法如下：
電泳結束以后，切取部分染色，然后根據染色結果切取含有蛋白質的膠帶裝入處理過的透析袋中，加入適量的緩沖液，最后把透析袋放入普通的核酸電泳槽中，并在電泳槽中加入適量的緩沖液（和透析袋中的緩沖液相同），低溫電泳2-3小時即可。回收蛋白所用的緩沖液一般和電泳所用的緩沖液相同。