一 原理:
聚丙烯酰胺凝膠電泳,具有分子篩和電泳的雙重作用,它的分辨力高,以此為電泳載體,可以將血清脂蛋白各組分分離。
血清中脂類物質均與血清載脂蛋白結合成水溶性的蛋白形式存在。各種脂蛋白中所含載脂蛋白的種類和數量不同,各種脂蛋白顆粒大小也相差較大,因此,用聚丙烯酰胺電泳,血清中的脂蛋白,可根據其所帶電荷的性質和多少,以及分子量的大小得到分離。
在本法中用乙酰蘇丹黑(脂類染料)和脂蛋白結合,染成黑蘭色,因此在電泳后不必染色,即可清楚地直接觀察電泳圖譜,進行組分分析,也可進一步采用分光光度法進行定量測定。血清蛋白經電泳后可分成五條帶,從陽極到陰極依次為α—脂蛋白,β—脂蛋白,前β—脂蛋白,乳糜微粒、染料(在點樣端)。
二 試劑:
l、20%丙烯酰胺溶液:取丙烯酰胺19.6克,雙丙烯酰胺0.4克,加蒸餾水溶解稀釋到100毫升,貯于棕色瓶中冰箱保存。
2、凝膠緩沖液:(0.5M)取三羥甲基胺基甲烷(Tris)6.057克,加入1M HCl 10毫升,最后稀釋到100毫升。
3、50%TEMED(四甲基乙二胺)
4、10%過硫酸銨溶液:取過硫酸銨0.5克,溶于5毫升蒸餾水中,(每周配制)。
5、人血清
6、乙酰蘇丹黑:取2克蘇丹黑,加60毫升吡啶,40毫升醋酸酐,混合放置過夜,再加3升蒸餾水,乙酰蘇丹黑即析出,抽濾后,再溶于丙酮中,將丙酮蒸發,剩下者即為乙酰蘇丹黑,將乙酰蘇丹黑溶于乙醇中制成飽和溶液。
7、25%蔗糖溶液
8、電泳緩沖液:(pH8.6),稱取Tris0.6克,甘氨酸2.28克,加蒸餾水溶解并稀釋至1000毫升,即為Tris—甘氨酸緩沖液。
三 儀器:
夾芯式垂直電泳槽、電泳儀、恒溫水浴、微量進樣器(50—100ml)、燒杯(50ml)、滴管。
四 操作步驟:
1、凝膠制備:
脂蛋白電泳一般采用分離膠和濃縮膠組成的凝膠板;下層為分離膠,約含4% 丙烯酰胺;上層為樣品膠,約含2.5%丙烯酰胺,制備方法按下述進行。
(1)分離膠制備:
20%丙烯酰胺溶液 2.4ml
凝膠緩沖液 1.2ml
蒸餾水 7ml
50%TEMED溶液 0.05ml
置小燒杯中,混勻,再加入10%過硫酸銨溶液0.15毫升,混勻,迅速用滴管分裝在二塊玻璃板之間,(玻片周圍的空隙先用硅橡膠條封住,放入電泳裝置中夾緊),凝膠加至紅色背景底線處),然后用注射器沿玻板壁小心地在膠面上滴加蒸餾水(約0.5cm),使凝膠形成時有一水平面,在室溫中放置30分鐘即可聚合完全。
(2)濃縮膠制備:
20%丙烯酰胺溶液 1.8ml
凝膠緩沖液 1.2ml
蒸餾水 7.0ml
50%TEMED溶液 0.05ml
置小燒杯中,混勻,再加10%過硫酸銨溶液0.15ml,混勻。將分離膠上層的水倒去,加入配制好的濃縮膠溶液,至紅色背景上線處,插入加樣梳,放45分鐘聚合后即可使用,使用前小心拔去加樣梳。
2、加樣
取人血清0.18ml,加乙酰蘇丹黑0.02ml,置37℃水浴保溫30分鐘,再加入25%蔗糖溶液0.2ml,然后用微量進樣器取此混合液適量加于凝膠的每個凹槽中。
3、電泳
在電泳裝置的左、右槽中分別注入Tris—甘氨酸緩沖液,樣品端接負極(短玻璃的一邊),電流控制在40—50mA,一般電泳約半小時,電泳時留心樣品的分離情況。
電泳結束將電泳圖譜畫在實驗報告上,并指出各條帶的名稱。