四、固定、，染色和脫色
將凝膠板放在培養皿中，加入固定液，浸泡數小時后，用脫色液清洗兩次，每次10min, 然后加入染色液，室溫下放置15－30min，再用脫色液洗脫數次，直至譜帶清晰，放入保存液中浸泡10min,可制干板。
五、制作干膠板
1. 取完全浸濕的平整玻璃紙一張，于玻璃板上鋪平，紙與板之間不可有氣泡。
2. 將凝膠鋪于上述玻璃紙上，對齊中心位置，使四邊留出距離相等，隨后將膠與紙之間的氣泡輕輕趕跑。然后，把另一張玻璃紙折起蓋在膠面上，并與下層玻璃紙對齊，膠與兩層玻璃紙之間要絕對避免氣泡，要求光滑平整。
3. 將凝膠四邊上下兩層玻璃紙貼緊，使膠邊邊緣上完全沒有氣泡。然后將各邊的玻璃紙多余部分折向玻璃板反面。
4. 置于室溫中自然干燥，完全干燥后的膠板，手感如觸及玻璃板。這時，可將膠板揭下，裁去邊角多余的紙，即可得一張圖譜清晰的干膠板。
注意事項
（1）支持介質
在IEF-PAGE中，丙烯酰胺純度極為重要，Acr及Bis中如有丙烯酸，則引起聚焦后pH剃度漂移，一般需用重結晶法進一步純化Acr及Bis。 最近Pharmacia公司推出Amberlite MB-6除去丙烯酸，其效果較再結晶法更佳。
（2）兩性電解質載體
兩性電解質載體是IEF-PAGE中最關鍵的試劑，直接影響pH梯度的形成，以及蛋白質
的聚焦。因此，要選用優質的兩性電解質載體，在凝膠中，其終濃度一般為1-2%。pH梯度的線性依賴于兩性電解質的性質，選擇哪種pH梯度范圍的兩性電解質載體，則與被分離蛋白質的pI有關。
（3）樣品預處理與加樣方法
實驗證實，鹽離子可干擾pH梯度形成，并使區帶扭曲。為了防止上述影響，進行IEF-PAGE時，樣品應透析或用Sephadex
G-25脫鹽，也可將樣品溶解在水，或是低鹽緩沖液中，使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。但某些蛋白質在等電點附近，或水溶液及低鹽溶液中，溶解度較低，則可在樣品中加入兩性電解質，如加入1%甘氨酸或對1%甘氨酸透析，雖然甘氨酸是兩性電解質，但不影響pH梯度的形成，可利用其在溶液中的偶極距作用增加蛋白質的溶解性。此外，還可在樣品及凝膠溶液中加入無離子去污劑如Tween
80, Triton X-100, Nonide P-40等或加入相同濃度的尿素(4
M)，以免氰酸鹽引起蛋白質的胺甲酰化，含有尿素的樣品及凝膠板只能當天使用。
加樣量取決于樣品中蛋白質的種類、數目及檢測方法的靈敏度。如用銀染色，加樣量可減少到1 μg。一般樣品濃度以0.5-3
mg/ml為宜，最適加樣體積為10-30 μl。如樣品很濃，可直接在凝膠表面加2-5
μl；如樣品很稀，可加樣300μl。值得注意的是：對不穩定的樣品可先將凝膠進行15-30
min預電泳使pH梯度形成，然后將樣品放再靠近pI的位置以縮短電泳的時間，但不要將樣品正好加在pI處和緊靠陽、陰極的膠面上，以免引起蛋白質變性造成區帶扭曲。一般加樣電泳半小時后，取出加樣濾紙以免引起拖尾現象。
（4）電功率、時間等因素
在IEF電泳中，隨著樣品的遷移越接近pI時，電流則越來越小。為使各成分能更好
地分離，要保持一定的電功率，就應不斷增加電壓，電壓增高可縮短pH梯度形成，和蛋白質分離所需的時間，但過高的電壓會使凝膠板局部范圍過熱，因此，在電泳過程中，應通冷卻水，水溫以4-10℃為宜，流量5-10
l/min。一般寬pH范圍電泳時間以1.5-2 h為宜。