聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳

【實驗目的】

1.掌握盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理。
2.學習盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術，用于分離蛋白質。

【實驗原理】

聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺作為支持物的一種電泳形式。單體-丙烯酰胺和交聯劑-甲叉雙丙烯酰胺相互作用可形成聚丙烯酰胺，該聚合反應以TEMED作為催化劑，以APS作為引發劑。

丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的比例可決定凝膠網孔的大小，交聯劑所占比重越大，凝膠的網孔就越小。

利用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白質分離主要依據以下兩個因素：
蛋白質所帶靜電荷：在不同的pH條件下蛋白質所帶電荷不同。在一定的電場條件下蛋白質將向與其所帶電荷相反的電極方向移動，移動速率取決于蛋白質表面電荷的數量，電壓越強或電荷越多則蛋白質移動的越遠。其次，蛋白質的形狀和大小：蛋白質在電泳中所受的阻力主要取決于樣品的大小與凝膠網孔大小之間的關系。蛋白質分子越小或凝膠網孔越大，所分離樣品所受阻力就愈小，則在電場中的遷移率就越大。在非變性電泳中，天然蛋白質的分離就是蛋白質所帶電荷、分子大小及分子形狀等因素共同影響，作用的結果。

濃縮效應可顯著提高聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率，該效應可通過引入濃縮膠和不連續緩沖溶液系統而獲得。濃縮膠處于分離膠的頂部，因此樣品在進入分離膠之前首先要經過濃縮膠。它是由較低濃度的丙烯酰胺構成，當樣品經過濃縮膠時由于膠內網孔較分離膠網孔大，樣品的移動速度較快，最終使樣品“堆積”在濃縮膠和分離膠之間。
另外，濃縮膠還具有比分離膠更低的pH。濃縮膠內的緩沖溶液是Tris- HCl（pH6.7）,該pH遠低于Tris的pK值(8.1)。分離膠內的緩沖溶液是pH8.9的Tris-HCl，而電泳正負兩極的緩沖溶液均為 pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖溶液。在濃縮膠中，小分子并帶有大量負電荷的Cl-在凝膠中的移動速率較快，而電荷較少且分子量較大的甘氨酸的移動速率較慢。由于二者在同一電場中，具有相同的電流，由此形成的電壓梯度導致甘氨酸離子始終跟隨在Cl-的后面，帶有負電荷的蛋白質樣品則濃縮在甘氨酸離子和 Cl-之間向正極移動。當樣品進入pH8.9的分離膠時，甘氨酸的解離度增加，在電場中的遷移率高于樣品，蛋白質不再夾于兩種離子之間向正極移動，這時的蛋白質依靠分子篩效應和電荷效應進行分離。
1. 實驗器材
Bio-Rad公司Mini-ProteanⅡ型電泳儀；電源（電壓200V，電流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf 管；微量注射器（50μl或100μl）；帶蓋的玻璃或塑料小容器；搖床。

2. 實驗試劑

凝膠溶液的配方

【實驗操作】
1.凝膠柱的制備
取l0cm×0.6cm的玻璃管，選擇較平整的一端為底端，量取7.5cm、8cm兩處，畫線；底端管口用小塊膠布封口，插入橡皮墊中，垂直放置于試管架中。用巴斯德滴管吸取分離膠，緩慢貼壁加膠到管內7.5cm處，立即加蒸餾水至8cm處。待分離膠凝固后，將膠面上的水分甩掉，殘留的水分用濾紙條吸干，用滴管速加濃縮膠到分離膠面上至8cm處，再小心地加一層覆蓋水。

2.安裝電泳槽
選擇無氣泡、無裂縫、長度合適的小玻璃管，撕掉膠布，安裝到電泳儀上，注意要緊密，以防止上槽緩沖溶液漏液；向下槽注入電極緩沖液，注意用彎頭滴管除去玻璃管下端的氣泡；再向上槽倒入電極緩沖液淹沒小管，同樣用滴管除去氣泡。

3. 加樣
用微量注射器取樣品液30μl，沿壁加在濃縮膠面上，注入時要慢，避免激起電極緩沖液。

4.電泳
連接電極，上槽與負極相連，下槽與正極相連；調節電流為lmA／管，待示蹤染料進入分離膠時調節電流為2mA／管，待示蹤染料接近凝膠管底部約0.5cm處，切斷電源，電泳時間為2小時~3小時。

5.剝膠
取下凝膠管，用局麻針頭注射器吸取一定量的蒸餾水，將針頭插入膠柱-與管壁之間，邊注水邊旋轉玻管，直至膠柱與管壁分開，然后用洗耳球輕輕在玻管的一端加壓，使凝膠柱從玻管緩慢滑出，將凝膠柱置于編號的試管內，用蒸餾水沖洗幾次。

6. 染色
將考馬斯亮藍染色劑倒入放有膠條的小試管中，沒過膠條；60℃水浴保溫40分鐘~50分鐘后取出，用水沖洗2次~3次，觀察結果。

【實驗結果】
觀察凝膠條中的蛋白質與考馬斯亮藍染色劑結合后所形成的藍色復合物，并通過畫圖記錄結果