2.3TaqmanMGB探針設計介紹
MGB探針的優點：
2MGB探針較短(14-20bp)，更容易找到所有排序序列的較短片段的保守區。
2短片段探針(14-20bp)加上MGB 后，Tm值將提高10℃，更容易達到熒光探針Tm值的要求。
2MGB探針的設計原則
2探針的5’端避免出現G，即使探針水解為單個堿基，與報告基團相相連的G堿基仍可淬滅基團的熒光信號。
2用primerexpress軟件評價Tm值，Tm值應為65-67℃。
2 盡量縮短TaqmanMGB探針，但探針長度不少于13bp。
2盡量避免出現重復的堿基，尤其是G堿基，應避免出現4個或4個以上的G重復出現。
2原則上MGB探針只要有一個堿基突變，MGB探針就會檢測到(MGB探針將不會與目的片段雜交，不產生熒光信號)。因此，在進行
SNP檢測時，為了檢測到突變子，即TaqmanMGB不與目的片段雜交，不產生熒光信號，探針目的片段產生熒光信號檢測將探針的突變位點盡量放在中間
1/3的地方。注意：為了滿足上述要求的4個條件，探針的突變位點可向3’端移動，但突變位點至少在離3’端2個堿基的前方(即必須確保探針的后兩個堿基是絕對的保守)，以進行SNP檢測。反過來，若要進行同類檢測，找的是保守片段區，探針中不應有突變位點。若探針即便是只有13個bp,探針仍不完全保守。有幾個突變，突變位點也應靠近探針的5’端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產生熒光信號。另一種方法是設計簡并探針，也可達到即使是突變，仍可檢測到突變。
2.4 實時多重PCR探針的選擇：
多重實時 PCR的多種含意有兩種：一為選擇保守的探針和引物，利用不同的染料標記探針，在檢測時可根據熒光的顏色來判定不同的產物。另一種為選擇保守的引物，擴增不同長度的目的片段，反應中加入SYBRN染料，最后根據不同目的片段的Tm值來判定不同的物品。
多重實時PCR的熒光探針應為同一類型：如同時為Taqman 探針、或同時為MGB探針、或同時為Beacon 探針。
在多重PCR中，多重PCR的各個引物之間相互干擾和各個探針之間相互干擾分析:
設計好各對引物和探針后，重新在用DNAstar軟件中的Primerselect軟件，打開保守在同一文件中的多重PCR的引物文件，然后兩兩分別選中所設計的多重引物或兩兩分別選中所設計的多重探針后，在“report”菜單下“primerpairdimers”,分析上下游引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對引物有多少個dimer，并對此對引物用dG值進行評價(通常給出最差的dG值，理論上是dG值越大越好)。
3、影響PCR及熒光PCR的其他因素
引物的設計和選擇符合熒光PCR的探針并進行設計對于實時熒光PCR尤其重要。可以說，不合理的設計意味著絕對的失敗。但是，好的設計并不等于好的實驗結果，影響PCR和熒光PCR的因素非常多，下面擇其重要進行介紹。
3.1引物退火溫度
引物的一個重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。
設定Tm有幾種公式。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。大部分計算機程序使用近鄰分析法——從序列一級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩定性。所有oligo軟件會自動計算引物的Tm值。在設置退火溫度時可以如下進行：以低于估算的Tm5℃作為起始的退火溫度，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會由于在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環，然后再根據較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環。這使得在較為嚴謹的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
3.2引物濃度
引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會導致非特異性產物擴增。為了確定引物濃度，可以在260nm（OD260）測量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數的倒數（nmol/OD），通過Beers法則（公式1）計算引物濃度。微摩消光系數可以使用公式2計算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數不同，確定引物的精確濃度必須使用計算的消光系數。這是因為引物較短，堿基組成差異很大。在oligo軟件上可以計算出引物的的消光系數（OD/μmol）和消光系數的倒數（μmol/OD）。
一般商業合成的引物以 O.D.值表示量的多少，在一般情況下，20個堿基長的引物，1個O.D.加100ul水后引物濃度為50pmol/ul（50μM）。也可以用 OLIGO軟件，根據引物的的消光系數（OD/μmol），計算出一定的工作濃度下，引物的加水量。
濃度(μM)＝A260（OD/ml）×稀釋系數×消光系數的倒數（nmol/OD）
舉例：計算某寡核苷酸（溶于1ml水中），取其中的 10μl稀釋100倍（加入990μl）水中。在A260處測吸光度為0.2。計算消光系數的倒數為4.8nmol/OD，代入得：
濃度＝0.2（OD/ml）×100×4.8（nmol/OD）＝96nmol/ml＝96μM