【實驗原理】
擴增片段長度多態性（amplified fragment length
polymorphisms,Amp-FLP）根據PCR技術原理，針對靶基因座的側翼序列設計一對特異性引物，采用適當的PCR
反應體系和熱循環條件，可擴增出該基因座等位基因。PCR
產物經電泳分離、顯帶后，雜合子為兩條長度不等的片段，純合子為一條片段。根據片段長度判定等位基因和基因型。
vWF III 位點是以TCTA 四個核苷酸為重復單位的短串聯重復位點，位于vWF 基因第40內含子中。
【實驗儀器】
Ependoff 管、微量加樣器、臺式離心機、PCR 擴增儀、電泳儀、電泳槽
【實驗試劑】
1.引物（10umol/L） 2.Taq DNA 聚合酶（0.5U/ul）
3.10× buffer 4.dNTP（每種25mM）
5.無菌去離子水 6.液體石蠟
7.聚丙烯酰胺母液(T＝30％，C＝5％) 8.TEMED（四甲基乙二胺）
9.PAS（10％過硫酸銨） 10.TBE（1X, 5X）
11.尿素
12.上樣緩沖液—0.25％溴酚藍，0.25％二甲苯青，98％甲酰胺
13.固定液—10％冰醋酸
14.染色液—2g AgNO3，3ml 37％甲醛溶于2L 水中
15.顯色液—60g Na2CO3，3ml 37％甲醛，400ul 12％硫代硫酸鈉溶于2L 水中
【實驗方法】
一、 PCR 擴增
1 PCR 擴增體系：無菌去離子水 8.5ul
10X Buffer 2ul
引物1 2ul
引物2 2ul
dNTP 1.5ul
Taq 酶 2ul
DNA 模板 2ul
總體系20ul(最后加模板)，其中含有1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，10mmol/L Tris
?HCl（pH8.4），dNTP 各187.5umol/L，Taq DNA 聚合酶1U，引物各1.0umol/L，模板DNA 50～100ng。
2.PCR 擴增條件：94℃預變性35sec；94℃變性45sec，58℃退火和延伸4min，30 次循環后于72℃繼續保溫8min。
二、 PCR 擴增產物的檢測
聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染：
凝膠制備: 聚丙烯酰胺母液(T=30%, C=5%) 4ml
5X TBE 4ml
尿 素 8.4g
加水至20ml, 配成終濃度T=30%, C=5%的工作液。在工作液中加入200ul PAS 和20ul TEMED 充分混勻后迅速灌入凝膠模，水平放置30min 凝集后即制成聚丙烯酰胺凝膠。
電泳：將凝膠板置于電泳儀上，電極緩沖液為1X TBE，將加有1／5 體積上樣緩沖液的PCR 擴增產物上樣電泳，10W 電泳1h 左右停止電泳。
顯譜： 200ml 固定液中固定30min。
蒸餾水洗3 次，每次3min。
200ml 染色液中染色30min。
蒸餾水快速沖洗凝膠一遍（20s 以內）。
加入200ml 顯色液，5min 左右顯色。
加入10％冰醋酸終止顯色，水洗后凝膠干燥保存。
三、結果判讀與分析
根據片段長度判定等位基因和基因型。雜合子為兩條長度不等的片段，純合子為一條片段。