問:什么是QPCR?
答:QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即實時熒光定量核酸擴增檢測系統,也叫實
時定量基因擴增熒光檢測系統,簡稱QPCR。
問:QPCR、DNA檢測、PCR之間的關系?
答:聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain
Reaction簡稱PCR)原理憑借敏感、特異、快速的特點榮獲93年諾貝爾化學獎。因其在病原體檢測方面的獨特優勢,因而發達國家在相關方法和儀器方面的研發非常快,成為分子生物學診斷的主流,至今仍處于學術和應用前沿:
第一代產品:
基因擴增熱循環儀(DNA Thermal Cycler)+電泳儀+紫外分析儀+定性試劑,構成PCR定性檢測。
第二代產品:
基因擴增熱循環儀+熒光儀+終點定量試劑,構成PCR-DNA終點法定量檢測(End-point quantitative PCR
detection),又分為終點酶免定量( End-point ELISA-PCR)和終點熒光定量(End-point
Fluor-PCR)兩種。
第三代產品:
實時定量QPCR儀+實時熒光定量試劑,構成QPCR-DAN/RNA實時熒光定量檢測。
問:相比以前的方法,QPCR有哪些特點?
答:QPCR至少有以下特點:
所用儀器少,只用一臺儀器。
檢測時間短,只須45分鐘~1小時10分鐘(試劑各異),而定性PCR須3~4小時,酶免終點定量須6~8小時,熒光終點定量須2~3小時。
操作極其簡單:前處理后,樣本插入儀器一小時后到電腦上來出報告即可,無須開蓋,移樣本(以前方法),避免污染。
結果精確:定性PCR只能定性,很粗略,終點定量PCR由于只能在40個熱循環結束后檢測熒光,被測熒光達到飽和導致定量不夠精確,屬于半定量狀態。而實時熒光QPCR是在擴增的每時每刻連續檢測各樣本的熒光值的變化。
檢測動態范圍:10~10000000000 DNA copies/ml
檢測精度:0.1RLU
辨別率:5000和10,000個模板拷貝樣本的辨別率99.7%。
問:QPCR的技術先進性、價格及應用現狀?
答:實時熒光QPCR是當今世界用于臨床的最先進核酸分子診斷技術,被美國FDA承認并推崇,被美國FDA批準并取得臨床應用執照的QPCR試劑品種有:
HBV乙肝病毒DNA,HCV丙肝病毒RNA,HIV艾滋病病毒RNA,Chlamydi
trachomatis(CT),性傳播疾病,沙眼衣原體,Neiserria
gonorrhea(NG),性傳播疾病,淋病雙球菌,Cytomegalovirus(CMV),性傳播疾病,巨細胞病毒,Mybobacterium
tuberculosis(Mtb),呼吸道疾病,結核分支桿菌等。
實時熒光PCR儀研發技術難度大,門檻高,發達國家也只有有限幾家知名公司生產,且售價昂貴:如
美國ABI/7700-120萬元,美國 ABI/5700-50萬元,瑞士Roche/Lightcycler-70萬元,美國Stratagene公司2005年新品MX3005P-80萬元
可見,在病人看來,哪家醫院應用了QPCR技術便是先進診斷技術的象征,在發達國家也是如此。
國產儀器情況:國產儀器生產單位不超過五家,其中包括:
日本獨資杭州博日實時熒光QPCR儀(33孔)
西安天隆科技有限公司TL988實時熒光QPCR儀(48孔)
以上產品均取得國家SFDA認證,報價均在45萬以上。
國產試劑情況:
多家公司生產實時熒光QPCR試劑盒,價格與終點法試劑相當,且品種齊全,價格便宜,購買方便:
乙肝HBV-DNA,丙肝HCV-RNA,艾滋AIDSHIV-RNA,性病系列:淋病雙球菌NG、沙眼衣原體CT、解脲支原體UU、皰疹病毒HSV、人體乳頭瘤HPV,優生優育系列:巨細胞病毒 CMV、弓形蟲COX等。