成功的RT PCR的要素
1、高質量RNA
成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質量決定了你能夠轉錄到
cDNA上的序列信息量的最大值。一般不必使用oligo（dT）選擇性分離poly（A）+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly（A）+
RNA，都可以檢測到擴增結果。另外，分離poly（A）+
RNA會導致樣品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產生偏差。但是我個人認為不會，除非mRNA抽提試劑盒或者相關方法對內參以及目的基因的mRNA有選擇性，否則樣本間抽提效率的差別完全可以用內參來校正。然而，當分析稀有mRNA時，poly（A）+
RNA會增加檢測的靈敏度。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩定。另外，長度大于4kb的轉錄本對于痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍體積的乙醇，室溫放置3-5分鐘，10，000×g離心5分鐘。也可以使用Qiagen等公司的特殊RNA保護試劑。
Merck的inhibitor是世界第一，大家可以選擇性使用。在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產量。RNase抑制劑要在第一鏈合成反應中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的
RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNase
A，B，C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。
2、使用無RNaseH活性（RNaseH-）的逆轉錄酶逆轉錄酶催化RNA轉化成cDNA。不管是M-mlV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產量和長度。因此消除或大大降低逆轉錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。而且降低逆轉錄酶的RNaseH活性會加大RT酶的熱穩定性。通常有點突變和缺失突變兩種，優先選擇缺失突變的。此外
AMV酶熱穩定性更高，推薦。
3、提高逆轉錄保溫溫度較高的溫度有助于RNA二級結構的打開，增加了反應的產量。對于多數RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物（三種引物都可以的）在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數二級結構，從而使引物可以結合。這個方法可以試一試。但是這個步驟之后反應條件如何設置我沒有經驗，是加入酶和其他反應組分后變性再RT還是直接開始RT程序？我認為后者才對。此外是否可以考慮加入RNA
inhibitor更為安全一些。還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉到逆轉錄保溫溫度，并加入預熱的2×的反應混合物提高特異性（cDNA熱啟動合成）。這種方法有助于防止較低溫度時所發生的分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度切換。然而某些模板仍然會存在二級結構，即使熱變性后也是如此。上面簡單的處理方法倒是不花錢，呵呵。對這些困難模板的擴增可以使用一些特殊的逆轉錄酶，逆轉錄反應可以置于較高溫度下進行，增加特異性，尤其是當使用基因特異性引物（GSP）進行cDNA合成時。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預計的保溫溫度相同。此外注意不要在高于60℃時使用oligo（dT）和隨機引物。隨機引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。此外RNA在高于65℃時開始水解，對于
≤1kb的RNA第一鏈合成溫度可以為70℃，對于＞1kb的RNA則需要＜65℃。
4、使用逆轉錄反應的增強劑包括甘油和DMSO在內的添加劑加到第一鏈合成反應中，可以減低核酸雙鏈的穩定并解開RNA二級結構，最多可以加入
20%的甘油或10%的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或MmlV的活性。AMV也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。為了在逆轉錄反應中最大限度提高RT-PCR的靈敏度，可以加入10%的甘油并在45℃保溫。如果1/10的逆轉錄反應產物加入到PCR中，那甘油在擴增反應中的濃度為
0.4%，這不足以抑制PCR。5、RNaseH處理在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應可以提高靈敏度。對于某些模板，據認為cDNA合成反應中的RNA會阻止擴增產物的結合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當擴增較長的全長cDNA目標模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的tuberous
scherosisⅡRNaseH的處理加強了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產生的信號。對于多數RT-PCR反應，RNaseH處理是可選的，因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復合物中的RNA水解掉。通常是不推薦此方法的。
三種RT引物的選擇
Oligo dT 要求RNA必須有Poly
A，所以真核生物的mRNA適用。他主要適合長鏈甚至全長mRNA的RT，這樣對RNA樣品的質量要求較高，最好不要有明顯的DNA污染，RNA降解和
RNA斷裂（如電泳中出現多條非典型的帶而又明確不是DNA帶那么就要考慮RNA出現斷裂的情況）其RT通常有標準濃度，比較好掌握。隨機引物適合各種
RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低），關于是否對具有復雜二級結構的模板有特殊的優點只能說maybe，事實上很多情況下我們是沒有分析RNA的二級結構的。（我用RNAstructure分析，但是一般分析發現復雜二級結構不是想到換用隨機引物，而是考慮做巢式
PCR或者考慮做二步PCR，因為引物設計處有連續復雜的二級結構設計引物就會設計不出來，但是如果引物退火處后面不遠就出現連續復雜的二級結構那么不用二級結構分析軟件是不容易發現的而且它也會嚴重影響PCR擴增）事實上引物退火后面不遠處如何出現嚴重連續二級結構是我們需要注意的，改用隨機引物做RT
倒是是比較好的選擇，但是如果不在PCR階段針對性的修改策略是不行的。特異性引物注意只能用你設計引物時的下游引物做RT，自己畫圖就明白了。適合各種
RNA的RT，適合序列肯定的模板，常用于一步法RT－PCR。但是引物設計質量影響RT的結果，而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以按照說明書按照一個溫度做不是最佳選擇，這樣對操作者的技戰術水平提出了嚴峻挑戰。所以通常適用于引物設計和合成有保障，引物退火處之后沒有復雜二級結構，目的模板豐度高（注意豐度高是指的目的gene的mRNA豐度高，與總RAN是兩個概念）的情況。通常不推薦。有些試劑核諸如Qiagen的RT試劑盒很討厭不帶隨機引物和Oligo
dT，這時可以先用特異性引物試一試，看看情況再說，做不出來也不要緊，這不是RT的最佳選擇，只是不用多花錢的妥協選擇而已^_^。至于其合成的
cDNA更為特異從而以后PCR更為特異的說法雖然有一定的道理，但是純屬于理論性質的，不能作為選擇他的原因。通常加入某個引物（模板其實沒有這個序列）RT，然后用這個引物擴增還是可以得到很多非特異擴增產物的，只是片斷一般不超過400bp。所以使用特異性引物特異性更高的說法不能全信，尤其是擴增片斷比較短的時候（小于400bp）。因為很少有RT酶可以在退火溫度反應而不失活的。除非少數耐熱的很貴的RT酶。