可能問題出在標本的保存：一般四小時之內就應處理，分離出細胞
說的是套式PCR,可以在你的第一次PCR兩個引物內,再設計一對引物進行第二次PCR就行了
如果你的第一次PCR剛好包括目的片段,那只好設計個更長的了
第二次的引物設計要求可以低一點
以50μl體系為例
引物各1μl
第一次PCR產物5μl
二次PCR和巢式PCR，即設計兩對引物進行擴增，不是一個概念，它是拿第一次的PCR產物，稀釋100-1000倍做模板，加入底物，從新進行擴增反應，以期增加產物的量
我做RT-PCR時,提總RNA時,都是用滅菌DEPC水,按1:100稀釋后測 OD260和OD280,后根據公式:RNA濃度=OD260*稀釋度/25(ug/ul),后用1mg total RNA分離mRNA.做逆轉錄及PCR,效果很好.
luoyu10 wrote:
各位大哥：
我有一個問題請教，RT- PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低為多少，如果太低是不是會影響結果？
最低到1.8，最好2.0，我感覺稍微低一點影響不算太大。
問：我是ＲＴ－ＰＣＲ的新手，想請教引物如何設計？
好的引物所具有的令人滿意的特點：
* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。
* 選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。
* 設計5'端和中間區為G或C的引物。這會增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。
* 避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。
* 避免3'末端富含GC。設計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。
* 避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
* 避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5' 端而不影響特異性。當計算引物Tm值時并不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。
有時候，僅有有限的序列信箱可供用于引物設計。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設計簡并引物。簡并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的堿基使用偏好，減少簡并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用簡并堿基，因為3'端最后3個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因為許多簡并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。
【經驗】如何確認RNA的質量
各位都知道，提取到質量良好的RNA（包括總RNA和mRNA，以下同）是非常困難，關于RNA的提取技術，我就不說了，為什么呢？或許各位非常關心呢，我是這樣想的，我可以看到的資料或者是廠家的說明書，各位也同樣可以看到的，內容當然都是一樣的了，所以實驗做的好不好，主要是心的投入多少的問題，所以希望大家自己多多思考啊！
以下兩種方法，相信大家都知道的：
1）檢測RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。
1.82.0時，我們認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的，不過要注意，當你用Tris作為緩沖液檢測吸光度時，R值可能會大于2（一般應該是<2.2的）。當R<1.8時，溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯，你可以根據自己的需要決定這份RNA的命運。當R>2.2時，說明RNA已經水解成單核酸了。
如果RNA的量夠，可在
260nm（A260）用分光光度法測定RNA的得率，1個單位等于40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比值為2.0。A260
/A230的比值還表明RNA的純度，其值小于2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇殘留，其值大于2.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA。
2）RNA 的電泳圖譜
一般的，RNA的電泳都是用變性膠進行的，但是根據我的經驗，如果你僅僅是為了檢測RNA的質量是沒有必要進行如此麻煩的實驗的，用普通的瓊脂糖膠就可以了。
電泳的目的是在于檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認為 RNA的質量是好的（見下圖）。
以上是我們常用的兩種方法，但是這兩種方法都無法明確的告訴我們RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我們很難察覺，但是大部分后續的酶學反應都是在37度以上并且是長時間進行的。這樣，如果RNA溶液中有非常微量的RNA
酶，那么在后續的實驗中就會有非常適合的環境和時間發揮它們的作用了，當然這時你的實驗也就完了。
下面，我們介紹一個可以確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。
3）保溫試驗
方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補充到10
ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
時間到了之后，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當然，它們的條帶也要符合方法2中的條件），則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。
如果你的RNA樣本通過了保溫實驗的檢測并且你在后續的實驗中還是非常小心的防范RNA酶的騷擾，那么你的實驗應該是很難失敗了。