室溫下充分混勻，離心10000g×2min。取上層液置另一0.5 ml離心管中，加入100μl氯仿，混勻，離心10000g×2min。將上層液轉移至另一0.5ml 離心管中，再加入3M NaAc 10μl、預冷無水乙醇250μl，混勻后，-20OC靜置30min。4OC離心13500g×10min。棄上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗滌，4OC離心13500g×2min, 棄上清液。室溫下揮發殘留乙醇。加入50μl雜交緩沖液溶解沉淀，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測探針質量。（參見本節電泳步驟）。
2．雜交
（1） RNA提取后溶解在雜交緩沖液中，濃度為1μg/μl。
（2）取8μl RNA加入1-3μl探針（根據探針檢測結果調整）于0.5ml 離心管中。
（2） 80OC保溫2min，然后40-45OC下雜交12-18hr。
3. 消化
(1) 雜交管于37 OC保溫15min，加入RNase消化液，37 OC保溫30min。
(2) 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混勻，37 OC保溫10min。
(3) 加入65μl飽和酚和65μl氯仿，混勻，室溫離心，10000g×2min。
(4) 轉移上層液到另一0.5離心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl異丙醇，混勻后，置-20OC 30min，4 OC離心,135000g×10min。
(5) 棄上清液，室溫下揮發乙醇，加入5-8μl上樣緩沖液溶解沉淀。
4、電泳與放射自顯影
（1）配制凝膠：(50ml)
40%丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺（19：1） 6.25ml
5×TBE 10ml
尿素 24g
加 H2O至50ml
溶解后加入25%過硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混勻，注入電泳槽中，插入梳，待膠凝固。
（2）預電泳
以1×TBE為上下槽電泳緩沖液，加上電壓后進行預電泳，如果用測序電泳裝置，電壓應達2000v以上，功率設定為100w，溫度設為50 OC。待膠板溫度達50 OC時，暫停電泳，準備加樣。
（3）加樣
將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80 OC加熱2min，立即加樣到膠孔中，電泳1-2hr。（電泳條件同預電泳）。
（3） 電泳結束后，打開膠板，用濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜，放置于暗盒中，暗室紅光下，壓上一張X片，蓋上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光結束后，將X光片顯影、定影、水洗、晾干。
三、注意事項
1．本實驗大部分為RNA操作，注意RNA酶的污染。
2．RNase消化液消化未雜交的單鏈RNA和探針RNA，當探針與樣品之間有堿基錯配時，錯配位點也將被消化，因此會產生片段較小的雜交片段。因此進行PCR時，采取盡量減少錯配的措施。
3、 同位素對RNA合成有一定影響，有時會產生非全長的探針。因此，標記時間不宜過長。
4、 RNase消化液有時會產生過度消化而無檢測信號，可以將消化液稀釋10-100倍后使用。