培養細胞的細胞生物學（體內外細胞差異與體外培...2

2．傳代期：
初代培養細胞一經傳代后便改稱做細胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持續時間最長。在培養條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系（Diploid Cell Line）。為保持二倍體細胞性質，細胞應在初代培養期或傳代后早期凍存。當前世界上常用細胞均在不出十代內凍存。如不凍存，則需反復傳代以維持細胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導致細胞失掉二倍體性質或發生轉化。一般情況下當傳代10～50次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。
3．衰退期：
此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態輪廓增強，最后衰退凋亡。在細胞生命期階段，少數情況下，在以上三期任何一點（多發生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細胞可能發生自發轉化（Spontaneous Transformation）。轉化的標志之一是細胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系（Infinite Cell Line），也稱連續細胞系（Continuous Cell Line）。在早期文獻中無限細胞系也稱已建立細胞系（Established Cell Line），現已不用。無限細胞系的形成主要發生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細胞轉化亦可用人工方法誘發，轉化后的細胞也可能具有惡性性質。細胞永生性和惡性性非同一性狀。
（二）組織培養細胞一代生存期
所有體外培養細胞，包括初代培養及各種細胞系，當生長達到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養液的性質、接種細胞數量和細胞增殖速度等有關。接種細胞數量大、細胞基數大、相同增殖速度條件下，細胞數量增加與飽和速度相對要快（實際上細胞接種數量大時細胞增殖速度比稀少時要快）。連續細胞系和腫瘤細胞系比初代培養細胞增殖快，培養液中血清含量多時細胞增殖比少時快。以上情況都會縮短傳代時間。
所謂細胞“一代”一詞，系僅指從細胞接種到分離再培養時的一段時間，這已成為培養工作中的一種習慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代（Generation）或倍增〔Doubling）不同；在細胞一代中，細胞能倍增3～6次。細胞傳一代后，一般要經過以下三個階段：
1．潛伏期（Latent Phase）：
細胞接種培養后，先經過一個在培養液中呈懸浮狀態的懸浮期。此時細胞胞質回縮，胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結束。各種細胞貼附速度不同，這與細胞的種類、培養基成分和底物的理化性質等密切相關。初代培養細胞貼附慢，可長達 10～24小時或更多；連續細胞系和惡性細胞系快，10～30分鐘即可貼附。細胞貼附現象是一個非常復雜和與多種因素相關的過程。支持物能影響細胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有一些特殊物質如纖維連接素（Fibronectin），又稱 LETS（Larger External Transformation Substance），細胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也參與貼附過程。這些物質都是蛋白類成分，它們有的存在于細胞膜的表面（如 CSP），有的則來自培養基中的血清（LETS）。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質。貼附是貼附類細胞生長增殖條件之一。
細胞貼附于支持物后，除先經過前述延展過程變成極性細胞，還要經過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期。細胞處在潛伏期時，可有運動活動，基本無增殖，少見分裂相。細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類和培養基性質等密切相關。初代培養細胞潛伏期長，約24～96小時或更長，連續細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅 6～24小時；細胞接種密度大時潛伏期短。當細胞分裂相開始出現并逐漸增多時，標志細胞已進入指數增生期。
2．指數增生期（Logarithmic growth Phase）：
這是細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多。指數增生期細胞分裂相數量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。一般以細胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數。體外培養細胞分裂指數受細胞種類、培養液成分、pH、培養箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數介于0.1%～0.5%，初代細胞分裂指數低，連續細胞和腫瘤細胞分裂指數可高達3%～5%。pH和培養液血清含量變動對細胞分裂指數有很大影響。指數增生期是細胞一代中活力最好的時期，因此是進行各種實驗最好的和最主要的階段。在接種細胞數量適宜情況下，指數增生期持續3～5天后，隨細胞數量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后，如培養的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現象稱接觸抑制（Contact Inhibition）。而惡性細胞則無接觸抑制現象，因此接觸抑制可作為區別正常與癌細胞標志之一。腫瘤細胞由于無接觸抑制能繼續移動和增殖，導致細胞向三維空間擴展，使細胞發生堆積（Piled up）。細胞接觸匯合成片后，雖發生接觸抑制，只要營養充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養液中營養成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養的枯竭和代謝物的影響，則發生密度抑制（Density Inhibition），導致細胞分裂停止。因此細胞接觸抑制和密度抑制是兩個不同的概念，不應混淆。
3．停滯期（Stagnate Phase）：
細胞數量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養液中營養漸趨耗盡，代謝產物積累、pH降低。此時需做分離培養即傳代，否則細胞會中毒，發生形態改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態。在這種情況下，雖進行了傳代，因細胞已受損，需要恢復，至少還要再傳1～2兩代，通過換液淘汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復后，才能再用。結果反而耽誤了時間，這是在實驗中應特別注意的。