體內組織細胞在體外培養時,所需培養環境基本相似,但由于物種、個體遺傳背景及所處發育階段等的不同,各自要求條件有一定差別,所采取的培養技術措施亦不盡相同,現介紹個別組織細胞培養的要點如下:
一、上皮細胞培養
上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分,又由于癌起源于上皮組織,故上皮細胞培養特別受到重視。但上皮細胞培養中常混雜有成纖維細胞,培養時生長速度往往超過上皮細胞,并難以純化,同時上皮細胞難以在體外長期生存,因此純化和延長生存時間是培養關鍵。
體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜,因此培養在有膠原的底物上可能利于生長,另外人或小鼠表皮細胞培養在以3T3細胞為飼養層(用射線照射后)時,細胞易生長并可發生一定程度的分化現象。降低PH、Ca2+含量和溫度,向培養基中加入表皮生長因子,均有利于表皮細胞生長。
以表皮細胞為例,用皮膚表皮和真皮分離培養法可獲得純上皮細胞,其法如下(黑木凳志夫 1981)
1、取材:外科植皮或手術殘余皮膚小塊,早產流產兒皮膚更好,取角化層薄者,切成0.5-1平方厘米小塊。
2、置0.02 A中,室溫,5分鐘。
3、換入0.25%胰蛋白酶中,4℃過夜。
4、分離:取出皮塊,用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。
5、取出表皮,剪成更小的塊后,置0.25%胰酶中,37℃,30-60分鐘。
6、反復吹打,制成懸液。
7、培養:用80目不銹鋼紗網濾過后,低速離心,吸去上清。
8、直接加入培養基(Eagle加20%小牛血清)制成細胞懸液,接種入培養瓶,CO2溫箱培養。
二、內皮細胞培養
內皮細胞易于從大血管分離培養成單層細胞,對于研究內皮細胞再生、腫瘤促血管生長因子(TAF)等有很大價值。
研究人內皮細胞培養以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡便,其法如下:
1、產后新鮮臍帶,無菌剪取10―15厘米長一段,如不能立即培養,可于12小時內保存于4℃。
2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血,在入口處用線繩扎緊,以防液體返流。
3、用血管鉗夾緊臍帶一端,從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶,充滿血管,消化3-10分鐘;注入口用線繩扎,以防液體返流。
4、吸出含有內皮細胞的消化液,于離心管中,注入溫PBS輕輕反復沖洗后,一并注入離心管中(此步驟可重復)。
5、離心去上清,加入RPMI1640培養液制成細胞懸液,接種入培養器皿中,置溫箱培養。兩至三天可見細胞長成單層。
三、神經膠質細胞培養
神經細胞(神經元)不易培養,只有在適宜情況下,如接種在膠原底層上,或加入神經生長因子和膠質細胞因子時,可出現一定程度的分化,長出突起等現象,但很難使之增殖。而神經膠質細胞是神經組織中比較容易培養的成分。
人、鼠等腦組織即可用于神經膠質細胞培養,不僅能獲得生長的膠質細胞,也可形成能傳代的二倍體細胞系。一般說來,膠質細胞在培養中生長不穩定,不易自發轉化,但對外界因素仍保持很好的敏感性,可用ROUS病毒和SV4等誘發轉化。