在全球范圍內原發性肝癌是造成癌癥相關死亡的三大原因之一。肝細胞癌(HCC)是最常見的原發性肝臟癌癥。由于缺乏高特異性和敏感性的早期診斷生物標志物，HCC患者往往得不到及時有效的治療。相比于長鏈非編碼RNA和miRNA，circRNA作為一種新型環狀RNA，具有共價閉合環狀結構，在組織和血液中具有高度穩定表達和存在的特點。并且已有研究證明circRNA在多種疾病發生發展中起到關鍵的調控作用，且可以作為高特異性和敏感性的生物標志物應用于早期的臨床診斷中，具有很好的應用前景。此外，m6A RNA甲基化修飾是哺乳動物中最豐富的RNA修飾類型。它在RNA的表觀遺傳調控中發揮著多種作用，包括mRNA的穩定性、選擇性剪接和miRNA的成熟過程。m6A修飾還可以調節甲基化轉錄本的結構，阻止或誘導其他RNA的結合。
近日，上海交通大學附屬胸科醫院于永春的團隊研究揭示了在HCC細胞系中高表達的circRNA_104075，其表達受HNF4a調控，circRNA_104075海綿吸附靶向抑制YAP表達的miR-582-3p，促進肝癌的發生和進展，也揭示了circ_104075在診斷HCC方面具有高達96%的敏感性和98.3%的特異性，具有作為診斷HCC的生物標志物的潛能。該研究成果以“circRNA_104075 stimulates YAP-dependent tumorigenesis through the regulation of HNF4a and may serve as a diagnostic marker in hepatocellular carcinoma”為題發表在Nature子刊《Cell Death & Disease》(IF 6.218)。
文章內容：
1. circ_104075在HCC組織中高表達
該團隊首先對先前已經報道過的三個HCC組織中circRNA表達數據(云序生物提供環狀RNA測序服務)進行合并分析，篩選到了一個高表達的環狀RNA分子，即circ_104075。并且與正常的癌旁組織相比，HCC中circ_104075明顯高表達。同時與其他先前研究報道過的HCC血清診斷標志物（DANCR, HULC, UCA1, miR-21 和 miR-223）相比，HCC患者中circ_104075表達上調的水平更顯著。
圖1. 肝癌患者circ_104075表達上調
2. HCC中circ_104075表達受HNF4a正調控
作者選擇了一些公認的HCC致癌的轉錄因子，通過敲除和過表達發現在這些轉錄因子中只有HNF4a的表達與circ_104075的表達正相關。相比于正常小鼠，HNF4a敲除小鼠肝的大小和重量明顯減少，同時circ_104075的表達也明顯降低；臨床HCC組織分析發現HCC患者中HNF4a的表達水平也是明顯上調，進一步證實了HNF4a的表達與circ_104075的表達成正相關的結論。
圖2. circ_104075表達受HNF4a正向調控
3. HNF4a是如何調控circ_104075的表達的？
為了驗證轉錄因子HNF4a是如何調控circ_104075表達的，作者通過預測發現HNF4a可以結合circ_104075啟動子（-1482 to -1296）的位點；接著利用ChIP-qPCR（云序生物提供此項實驗）捕獲HNF4a沉淀復合物后，在HCC組織和HCC細胞系中都發現了HNF4a可以結合circ_104075啟動子（-1482 to -1296）的位點；熒光素酶報告基因實驗也證實了過表達HNF4a可以明顯促進circ_104075啟動子的熒光素酶活性，而敲低HNF4a表達抑制circ_104075啟動子的熒光素酶活性；如果突變circ_104075啟動子上HNF4a結合位點，過表達或者敲低HNF4a表達則對其熒光素酶活性無明顯影響，揭示HNF4a通過結合circ_104075啟動子，正向調控其表達。
圖3. HNF4a結合circ_104075的啟動子
4. circ_104075促進YAP（致癌信號通路）的表達
接下來，作者探究了circ_104075在HCC中可以調控哪些致癌信號通路。通過敲除和過表達circ_104075后發現，只有YAP所涉及的相關促進HCC的信號通路的改變，YAP與circ_104075的表達呈正相關，并且YAP是公認的HCC促進因子。臨床驗證也同樣揭示了YAP的表達與circ_104075的表達呈正相關的結論。
圖4. circ_104075正調控YAP表達
5. circ_104075可以結合miR-582-3p
作者首先想到circRNA通過海綿作用吸附miRNA，直接調控靶蛋白的表達，作者利用miRanda數據庫預測了circ_104075最有可能結合的5個miRNA，接著通過RNA pull down技術（云序生物提供此項實驗）捕獲復合物后RT-qPCR檢測發現只有miR-582-3p存在結合；通過構建突變形式circ_104075和miR-582-3p，熒光素酶報告基因實驗證實了WT circ_104075和WT miR-582-3p的結合，WT miR-582-3p可以抑制WT-、Mut1-和Mut2 -circ_104075的酶活性，而抑制不了Mut3 circ_104075的酶活性，提示circ_104075該結合位點的5’和3’端序列對于miR-582-3p的結合至關重要。同時Mut miR-582-3p則無法抑制circ_104075的酶活性。
圖5. circ_104075直接結合miR-582-3p
6. miR-582-3p可以靶向結合YAP-3’UTR
已經證實了circ_104075可以結合miR-582-3p，同時circ_104075與YAP表達成正相關，那么問題來了，miR-582-3p是否靶向調控YAP表達呢？進一步研究證實了miR-582-3p表達與YAP表達的負相關性， 通過預測發現miR-582-3p的5’端可以結合YAP mRNA 的3’UTR的三個位點，對這三個位點進行突變后進行熒光素酶報告基因實驗，發現miR-582-3p無法抑制Mut1-YAP-3’UTR，說明YAP mRNA 的3’UTR（315-321堿基序列）對于miR-582-3p的5’端的結合很重要；通過敲低circ_104075后抑制miR-582-3p，證明了miR-582-3p在circ_104075促進YAP表達過程中發揮著重要作用。
圖6. YAP-3’UTR是miR-582-3p的靶點
7. YAP-3’UTR的m6A修飾水平促進miR-582-3p的結合
通過MeRIP-qPCR（云序生物提供此項實驗）檢測到了P1-YAP-3’UTR (235-419 堿基序列)的表達上調，而該區域對于miR-582-3p的結合也很重要。YAP-3’UTR （235-419區域）中的353-357區域存在m6A motif（RRACU）——AGACU，通過突變這位點堿基后過表達進行MeRIP-qPCR，發現只有不突變最后三個堿基ACU的YAP-3’UTR的m6A修飾水平不會降低。同時熒光素酶報告基因實驗也證實了YAP-3’UTR 353-357區域的AGACU對于miR-582-3p結合后發揮抑制功能來說是至關重要的。臨床組織樣本的MeRIP-qPCR也證實了HCC患者組織的YAP-3’UTR 353-357區域的m6A修飾水平明顯降低，與HCC患者的YAP表達上調存在一致性。
圖7. YAP-3’UTR中的m6A修飾促進了其與miR-582-3p的相互作用
8. circ_104075在HCC中的臨床診斷意義
通過對一系列消化系統疾病的分析發現，相對于其他消化系統癌癥， circ_104075在HCC患者血清中高表達是具有特異性的，并且隨著HCC的進展呈現正相關性，同時手術治療后HCC患者血清中的circ_104075表達水平明顯降低；ROC曲線分析發現，相對于HCC中其他一些應用的生物標志物來說，血清circ_104075表達水平具有更高的敏感性和特異性，提示其可作為診斷HCC的生物標志物從而應用于臨床中(云序生物提供環狀RNA實時定量PCR服務)。
圖8. 血清circ_104075可作為HCC診斷的生物標志物
綜上所述，該研究闡明了circ_104075在HCC中上調的機制以及其下游調控HCC腫瘤發生的機制。并且揭示circ_104075可以作為一種新的肝癌診斷生物標志物和治療靶點。
全文鏈接
https://www.nature.com/articles/s41419-018-1132-6
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