大規模培養常用方法（貼壁培養、懸浮培養與固定化培養）-2
CelliGen、 CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應器是常用的貼壁培養式生物反應器，用于細胞貼壁培養時可用籃式攪拌系統和圓盤狀載體。此載體是直徑6毫米無紡聚酯纖維圓片，具很高表面積與體積比（1200cm2/g），利于獲得高細胞密度。籃式攪拌系統和載體培養是目前貼壁細胞培養使用最多方式，用于雜交瘤細胞、Hela細胞、293細胞、CHO細胞及其它細胞培養。此種方式培養細胞，細胞接種后貼壁快。
三、懸浮培養（suspension culture）：是指細胞在反應器中自由懸浮生長的過程。主要用于非貼壁依賴型細胞培養，如雜交瘤細胞等；是在微生物發酵的基礎上發通起來的。
無血清懸浮培養是用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細胞培養方式，它能減少后期純化工作，提高產品質量，正逐漸成為動物細胞大規模培養的研究新方向。
四、固定化培養（immobilization culture）：是將動物細胞與水不溶性載體結合起來，再進行培養。上述兩大類細胞都適用，具有細胞生長密度高，抗剪切力和抗污染能力強等優點，細胞易于產物分開，有利于產物分離純化。制備方法很多，包括吸附法、共價貼附法、離子/共價交聯法、包埋法、微囊法等。
1.吸附法:用固體吸附劑將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法稱為吸附法（adhesion）。操作操簡便、條件溫和、是動物細胞固定化中最早研究使用的方法。缺點是：載體的負荷能力低，細胞易脫落。微載體培養和中空纖維培養是該方法的代表，稍后專門介紹。
2. 共價貼附法:利用共價鍵將動物細胞與固相載體結合的固定化方法稱為共價貼附法（attachment by covalent bonding）。此法可減少細胞的泄漏，但須引入化學試劑，對細胞活性有影響，且因貼附而導致擴散限制小，細胞得不到保護。
3. 離子/共價交聯法:雙功能試劑處理細胞懸浮液，會在細胞間形成橋而絮結產生交交聯作用，此固定化細胞方法稱為離子/共價交聯法（cross- linking by covalent bonding）。交聯試劑會使一些細胞死亡，也會產生擴散限制。
4.包埋法:將細胞包埋在多孔載體內部制成固定化細胞的方法稱為包埋法（entrapment）。優點是：步驟簡便、條件溫和、負荷量大、細胞泄漏少，抗機械剪切。缺點是：擴散限制，并非所有細胞都處于最佳基質濃度，且大分子基質不能滲透到高聚物網絡內部。一般適用于非貼壁依賴型細胞的固定化，常用載體為多孔凝膠，如瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白。
5.微囊法（microencapsulation）:是用一層親水的半透膜將細胞包圍在珠狀的微囊里，細胞不能逸出，但小分子物質及營養物質可自由出入半透膜；囊內是種微小培養環境，與液體培養相似，能保護細胞少受損傷，故細胞生長好、密度高。微囊直徑控制在200-400μm為宜。制備中應注意：
●溫和、快速、不損傷細胞，盡量在液體和生理條件下操作；
●所用試劑和膜材料對細胞無毒害；
●膜的孔徑可控制，必須使營養物和代謝物自由通過；
●膜應有足夠機械強度抵抗培養中攪拌。
五、抗凋亡策略在細胞大規模培養中的應用
生物反應器動物細胞大規模生產過程中，細胞凋亡在細胞死亡中占主要部分。最近研究顯示在大規模培養生物反應器中細胞的死亡中80%是凋亡所導致,而不是以前所認為的壞死。而在大規模細胞培養中，細胞死亡是維持細胞高活性和高密度的最大障礙。理論上講，防止或延長細胞死亡，可以極大提高生物反應器生產重組蛋白的產量。
細胞凋亡由一系列基因精確地調控，是多細胞生物發育和維持穩態所必需的生理現象。已知凋亡的最終執行者是Caspase家族，它們均為半胱氨酸蛋白酶，各識別一個4氨基酸序列，并在識別序列C端天冬氨酸殘基處將底物切斷。Caspase含有可被自身識別的序列，可以切割活化自身而導致信號放大，并作用于下游Caspase成員，從而形成Caspase家族的級聯放大，最終作用于效應蛋白，引起細胞凋亡。
所以在大規模培養時干擾細胞在培養中凋亡的發生，提高細胞特異性抵制遇到壓力而引起凋亡的能力，有利于提高細胞的培養密度、延長細胞的培養周期，從而提高目標產品的產量2-3倍。
1.營養物質抗凋亡
在常規生物反應器構造中，營養耗竭或缺乏培養基中特殊的生長因子則引起凋亡，例如血清，糖或特殊氨基酸的耗盡。培養基中添加氨基酸或其它關鍵營養可抑制凋亡、延長培養時間從而提高產品的生產。大規模培養中細胞凋亡主要由于營養物質的耗竭或代謝產物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發生，補加谷氨酰胺已不能逆轉凋亡。另外，動物細胞在無血清、無蛋白培養基中進行培養時，細胞變得更為脆弱，更容易發生凋亡。
2.基因抗凋亡
與凋亡相關的一系列基因產物可對其進行正、負向的調控，因此可通過導入相應基因來調節細胞凋亡的機制。Bcl-2基因是目前最為有效的抗凋亡基因，在多種細胞系中均表現出很強的抗凋亡活性。
3.化學方法抗凋亡
凋亡發生時細胞許多部位發生生化物質的改變，有些變化如改變細胞氧化還原條件產生活性氧在凋亡信號階段發生，其它的如破壞線粒體膜電位、激活
caspase則發生在凋亡效應階段，這在絕大多數細胞死亡中是相同的。因此,阻止這些生化物質的改變可能阻止或至少延遲細胞凋亡的發生，運用化學物質可抑制信號效應階段的發生，被認為是抗調亡策略之一。