TFIIB與預啟動復合物結合后，致使RNA聚合酶II和TFIIF結合到轉錄啟始區。故TFIIB在預啟動復合物的形成中有重要作用。當用純化的
TFIID作凝膠遷移實驗時，poly dI-dC不用加入結合反應中。結合緩沖液含10%甘油，20mM Tris（pH8.0）， 10mM
MgCl2, 2mM DTT, 89mM KCl。對TFIID的凝膠結合實驗中，可加入poly
dG-dC。形成的復合物在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，凝膠組分是：0.5′TBE，6%聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺：雙叉=19:1），4mM
MgCl2，0.02%NP-40。當研究含TFIID和TFIIB的復合物時，應從結合緩沖液，凝膠，和電泳緩沖液中去除
MgCl2。這些是一般的要求，用不同的細胞抽提物和TFIID、TFIIB形成復合物作凝膠遷移實驗時，應對多種因素進行優化以達到理想的條件。
（7）在一次凝膠遷移實驗中，用多少量的蛋白質或抽提物，和標記的DNA探針？
對每一個特定的結合蛋白和探針，所用的純化蛋白，部分純化蛋白，粗制核抽提液需作優化，一般所用純化蛋白的量在20-2000ng間，可將蛋白：DNA的等摩爾比調整為蛋白的摩爾數是DNA的5倍。用粗制核抽提液，需要1-20μg蛋白形成特異的復合物。所加入反應的探針的量是50000-200000cpm32P-標記的探針（高特異活性），反應體積為1-5μl。這相當于10-50fmoles的DNA探針。探針應保存在-20℃以防止降解，在合成或標記后1-2個星期內必需使用。無論探針或是結合蛋白應避免多次凍融。
（8）能用體外翻譯法制備目的蛋白質嗎？
Promega沒對所有的轉錄調節因子作這類測試。一般，用麥胚抽提物作哺乳細胞轉錄因子或DNA結合蛋白的體外翻譯，兔網織紅細胞溶裂解液可能含有內源哺乳細胞轉錄因子或DNA結合蛋白。但TNT?/sup>兔網織細胞溶解液系統（a,b,c,d）與TranscendTM
生物素標記的tRNA一同使用，翻譯了轉錄調節因子AP1（c-Jun），它使AP1同源寡核苷酸產生的遷移效果和重組的AP1相同。
TNT/sup>T7偶聯的麥胚抽提物（b,c,d,e）在體外翻譯了c-Rel。這一蛋白特異地使免疫球蛋白k輕鏈增強子探針產生遷移。在c-
Rel結合反應中加入體外翻譯的MAD-3（IkB家簇中一員）可干擾其相互作用。
（9）poly（dI:dC）dI:dC，非特異性競爭DNA,特異性競爭DNA的功能是什么？
它由肌苷和胞嘧啶組成。由于其特定的結構，可抑制蛋白對標記探針的非特異結合，避免假復合物。
在凝膠遷移反應中加入poly（dI:dC）dI:dC，可抑制粗制核抽提液中其它DNA結合蛋白結合，比如轉錄調節因子的非特異結合。當用純化的蛋白作凝膠遷移反應時，不必一定加入poly
dI:dC，如加入，則普通反應中所用終濃度不超過50-100ng。對核抽提液，每2-3μg核抽提液用1μg poly
（dI:dC）dI:dC。為確定所形成的復合物的特異性，在含或不含增量的非放射性的特異競爭DNA或非特異的競爭DNA時，作結合反應的競爭實驗。一般，非放射性的特異DNA是非標記的DNA探針，非特異的競爭DNA
，長度組成和DNA探針相同，序列不同。用非放射性的特異DNA能競爭掉，而用非特異的競爭DNA不能競爭掉的復合物，表明目的蛋白和同位素標記探針的特異結合。非特異結合能用特異DNA和非特異的競爭DNA競爭掉。結合溶液中的poly（dI:dC）dI:dC的量需作優化，但一般用
0.05mg/ml。非放射性的（特異或非特異）的競爭DNA的用量也需優化或滴定，但競爭DNA通常是同位素標記的探針的10-1000倍（w/w）。其他類型的競爭DNA，如小牛胸腺DNA不能用于凝膠遷移反應，它們會帶有目的蛋白的結合位點。
（10）用什么凝膠條件將蛋白質/探針復合物和游離的探針分離開？
將結合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結合，蛋白/探針復合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度一般為6%（丙烯酰胺：雙叉=30:1），在特定條件下可用高或低的濃度。PH，聚丙烯酰胺的濃度，
丙烯酰胺與雙叉丙烯酰胺的比會影響復合物在凝膠中的遷移。大多數蛋白用10-15伏的電壓，解離快的蛋白用短時間和高的電壓（30-35伏的電壓），電泳時所用的TBE和TAE必需是新配制的，無沉淀。低的離子強度和丙烯酰胺基質的“箱子效果”有助于復合物的穩定。也可將TGE緩沖液（12.5mM
Tris，pH8.3，95mM甘氨酸，0.5mMEDTA）用于不穩定的蛋白/DNA復合物。可在40℃進行結合和電泳實驗以阻止不穩定復合物和探針的解離。加樣樣品液中的色素會導致不穩定復合物的解離，應用不含考馬斯蘭和二甲苯藍的加樣樣品液。當帶型不緊密出現拖尾時，表明復合物存在解離。凝膠必需完全聚合，以避免帶型拖尾。如復合物不進入凝膠則表明所用的蛋白或探針過量，或鹽的濃度過量不適用于這一反應。在含抽提液的帶中不含游離探針或復合物，但只含探針的帶中有探針表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，應在抽提液中和結合反應中加入相應的抑制劑。目前可用高強度瓊脂糖凝膠分離蛋白/探針復合物（Metaphor/sup/agarose）。
（11）如何在一個特定的復合物中確定一個蛋白質的存在？
部分純化的蛋白或粗制核抽提液和一個特定的探針可形成一個或幾個特異的蛋白復合物。多個復合物的存在表明蛋白降解，應在制備抽提液的溶液中和結合反應中加入蛋白酶抑制劑。確定復合物中蛋白的特征可能會困難，但有一些方法作這方面的研究。如有目的蛋白的抗體，可進行超遷移實驗，抗體和蛋白/探針復合物中的蛋白結合，使復合物的遷移延遲，形成超遷移。增量的抗體加入到結合反應中。抗體可加入到蛋白和探針反應后，也可將抽提物與抗體結合后，再加入探針。取決于抗體的特定的抗原決定簇，前者有利于超遷移復合物地形成，后者阻止復合物的形成導致原復合物的強度的減少。在大多數實驗中，應對抗體作滴定，先使抗體：蛋白的摩爾比為1:1，然后應需要增加抗體的量。當有純化的蛋白時，可用它們和實驗的帶型遷移復合物比較。除超遷移實驗外，復合物中蛋白的特征也可用
UV交聯和標記轉移來分析。在均質標記的探針和細胞核抽提物保溫后，用UV照射使復合物交聯，隨后用DNA酶降解未保護的探針。需用均質標記的探針，因
DNA酶會從末端標記的探針中除去標記。和保護的幾個核苷酸交聯的蛋白在變性聚丙烯酰胺凝膠中經電泳分離，干燥，放射自顯影。結合蛋白的分子量可和標準分子參照物比較。也可用目的蛋白的抗體對復合物做Western
Blotting分析。如一個蛋白和DNA探針的特定序列結合，可用含保守結合序列的競爭寡核苷酸，以及突變體來確定它的特征。也可用定點突變將保守序列結合位點改變來研究復合物的形成。