3.免疫探測 包括被轉印到膜上的靶抗原與第一抗體（特異抗體）反應、與酶標第二抗體 (抗抗體) 反應，以及用酶相應的底物處理后進行靶蛋白（抗原）信號檢測。
（1）用0.01mol/L PBS洗膜，5min×3次。
（2）加入封閉液（5％脫脂奶粉或2％牛血清白蛋白），浸泡被轉印膜，室溫或37℃（平緩搖動）反應1～3h，以封閉轉印膜上一些非特異性蛋白質的潛在結合位點，避免非特異性反應。
（3）棄封閉液，用0.01mol/L PBS洗膜，5min×3次，振蕩。
（4）將封閉好的轉印膜浸入第一抗體溶液（按合適稀釋比例，用1/2量0.01mol/L
PBS加1/2量封閉液稀釋）中，抗體液用量約0.2ml/cm2，37℃反應1～2h或4℃反應12h以上，保持平緩搖動。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實驗組相同。
（5）棄一抗，用0.01mol/L PBS分別洗膜，10min×3次，振蕩。
（6）加入辣根過氧化物酶（HP）偶聯的二抗溶液［稀釋方法同（4）］，室溫下反應1～2h，保持平緩搖動。
（7）棄二抗，用0.01mol/L PBS洗膜，10min×4次，振蕩。
4． 靶蛋白（抗原）檢測
（1）化學發光劑（ECL）檢測轉印膜上靶蛋白信號（近年多用），具體操作按ECL說明書進行，然后于暗室中用膜對X光片曝光，將所得Ｘ光片上的信號條帶進行灰度掃描，計算其積分光密度值。新問世的“化學發光數字成像分析儀”已將曝光、掃描與光密度分析集于一體，既減少信號損失，又方便結果保存，還節省膠片。
（2）顯色反應檢測轉印膜上靶蛋白信號（以往常用），將膜放入相應顯色劑（DAB）中，避光顯色至出現條帶時放入雙蒸水中終止反應。陽性反應將在靶蛋白相對應的位置上出現有顏色的條帶。
檢測完畢后，將NC膜浸泡于洗脫液（100mmol/L-ME， 20g/L SDS，62.5mmol/L Tris-HCl，pH6.7）中，50℃，振蕩30min，以去除膜上抗體，供再次檢測用。
【注意事項】
1.一抗的選擇是影響免疫印跡成敗的主要因素。多克隆抗體結合抗原能力較強、靈敏度高，但易產生非特異性的背景；單克隆抗體識別抗原特異性較好，但可能不識別在樣品制備時因變性而失去了空間構型的抗原表位，且易發生交叉反應。因此，兼有多克隆抗體和單克隆抗體優點的混合單克隆抗體近年特別被推薦，它是由一組能與抗原分子中的不同且不易變性的抗原表位結合并不易出現交叉反應的單克隆抗體混合構成。
2.如果反應靈敏度不高，可增加凝膠的厚度到1.5mm（厚度超過2.0mm時，凝膠轉移效率受限）；也可在電泳條帶不發生變形的前提下，盡量提高蛋白樣品的上樣量。
3.濾紙/凝膠/轉印膜/濾紙夾層組合中不能存在氣泡，可用玻璃棒在夾層組合上滾動將氣泡趕出，以提高轉膜效率；上下兩層濾紙不能過大，避免導致直接接觸而引起短路。
4.如果出現非特異性的高背景，可觀察僅用二抗單獨處理轉印膜所產生的背景強度，若高背景確由二抗產生，可適當降低二抗濃度或縮短二抗孵育時間；并考慮延長每一步的清洗時間。
5． 一抗與二抗的稀釋度、作用時間和溫度對檢測不同的蛋白要求不同，須經預實驗確定最佳條件。
6.一般情況使用0.45μm的NC膜，0.1～0.2μm的小孔徑膜只適合于分子量小于20kD的蛋白質。
7.PVDF尼龍膜較NC膜柔軟、結實、靈敏度高，易于操作且蛋白質結合能力強（PVDF膜可結合蛋白質480μg/cm2，而NC膜只能結合蛋白質80μg
/cm2）；缺點是PVDF尼龍膜背景也高，需要加強封閉；此外，PVDF尼龍膜若在使用前先行甲醇處理5～10s，以活化膜表面的正電基團，使它更容易與帶負電的蛋白質結合，可提高蛋白質在膜上的保留指數。
8． 使用化學發光檢測時，試劑須按需要量臨用前配置混合。
9.由于使用X光膠片檢測化學發光時不易控制曝光強度，而X光膠片的黑度水平僅僅是在一個很窄的曝光范圍內呈線性關系，因此有條件可選用化學發光成像掃描系統進行精確定時連續檢測，以得到最好信噪比的圖像進行定量分析。
10． DAB有潛在的致癌可能，操作時要小心仔細。