LCM顯微切割

這段時間做的LCM顯微切割少量組織，提取ng量級RNA的過程奉上。此類RNA可以經兩輪擴增后上樣進行基因芯片的研究；或直接作為模板進行RT-PCR的研究。雖然過程復雜一些，目前看效果還是不錯。

標本來自新鮮的動物或人體的組織標本，取材后液氮速凍后，－80℃存放備用。

標本冰凍切片的要求：

1.每例標本切取覆膜切片5張，玻璃切片一張，厚度8 μm，不染色。切片過程中盡量保持冰凍低溫，保持無RNA酶狀態。
2.每張切片放置一張組織切片，盡量減少“粗切”。
3.用抗RNA酶液清潔所有標本可能接觸的地方，包括手套、切片、切片盒。用全新的切片盒運送切片。
4.每個標本相對應的切片應該標記相應標本的標號以及切取的連續號碼。所有切片剩余的組織重新放入原來的標本儲存管中，－80℃存放。
5.每例標本均應用一枚新的刀片，并且用抗RNA酶液擦拭，防止 RNA的交叉污染。
6. 玻片經H&E染色保存備查，或用HE玻片來判斷標本的質量，如果玻片的細胞形態完整，則認為標本質量較好，在接著切覆膜切片。

冰凍切片的顯微切割過程：

每張覆膜冰凍切片經過H&E染色后，在Leica LMD6000顯微切割系統進行腫瘤細胞和腫瘤間質的分選。

H&E染色的過程包括：

⑴將準備切割的切片從-80℃冰箱取出，室溫放置30s；

⑵70%酒精5s；

⑶DEPC水10s；

⑷Gill’s #2 蘇木素染液30s；

⑸DEPC水10s；

⑹Scott’s TAP 水10s；

⑺70%酒精5s；

⑻伊紅3-10s；

⑼95%酒精10s；

⑽95%酒精10s；

⑾100%酒精10s；

⑿100%酒精10s；

⒀二甲苯30s；

⒁二甲苯3min；

⒂室溫干燥5min。

LEICA LMD6000 顯微切割

1.按順序打開顯微操作平臺、激光發生器、軟件計算機的電源。

2.打開LEICA顯微切割操作軟件。

3.設置軟件操作參數：放大倍數為20×；線條為連續，封閉；切割精度為精確切割；切割時間為選擇后切割。

4.將切片放置于載片架上，將0.5ml PCR管放置于持管架上，管蓋內加入50μL細胞溶解緩沖液。

5.選定目標細胞群，點擊開始切割，附有選定的目標細胞群PEM膜即會落入管蓋的細胞溶解緩沖液中。

RNA的抽提（ARCTURUS PICOPURE RNA 抽提試劑盒）

1.將包含目標細胞群的細胞抽提緩沖液（來自LCM）經瞬間離心至管底，PCR管在42℃孵育30分鐘。

2.800g離心2分鐘。

3.細胞抽提緩沖液可以置于-80℃保存，或進入下一步抽提。

4.將RNA純化離心柱加入預處理緩沖液250μL，室溫放置5分鐘，16000g離心1分鐘。

5.在細胞緩沖液管中加入50 μL 70%酒精，槍頭吹勻混合液，禁止離心。

6.將酒精和細胞緩沖液的混合液加入預處理的離心柱（100-200 μL）。

7.100g離心2分鐘，接著16000g離心30秒。

8. 加100 μL洗滌緩沖液1至離心柱，8000g離心1分鐘。
此時可同時進行DNase酶抑制步驟：加5 μL無RNase酶DNase酶儲存溶液至35 μL RDD緩沖液，緩慢混勻；加此40 μL混勻液至離心柱，在室溫放置15分鐘；加40 μL洗滌緩沖液1至離心柱，8000g離心15秒。

9.加100 μL洗滌緩沖液2至離心柱，8000g離心1分鐘。

10.加100 μL洗滌緩沖液至離心柱，16000g離心2分鐘。檢查離心柱，如有液體殘留，則再次離心1分鐘。

11.將離心柱轉移至新的1.5ml EP管。

12.加11 μL（不超過30 μL）洗提緩沖液至離心柱的濾膜上。

13.室溫下放置1分鐘， 1000g離心1分鐘，接著16000g離心1分鐘洗提RNA。取1μL RNA溶液應用Aglient 2100 分析儀，RNA 6000 pico 芯片，檢測RNA的質量。剩余RNA -80℃保存備用。

應用RNA Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA 質量和數量

Ladder準備：試劑盒內的所有試劑均升溫至室溫。第一次應用RNA 6000 ladder：取5 μL ladder至1.5ml EP管，加熱至70℃ 2分鐘，瞬間離心，冰上驟冷；加入745 μL 無RNA酶水，震蕩后瞬間離心，將液體分裝成10 μL每小管后于-80℃保存。
膠的準備：將550 μL的RNA6000 pico 膠基置于離心濾膜柱，1500g離心10分鐘，將膠分裝成65 μL每小管置于4℃保存，1個月內用完。
使用前，將RNA pico kit在室溫下放置至少30分鐘。

步驟

1.將65μL的濾過膠放置于1.5ml的EP管中。

2.震蕩RNA 6000 Pico染色濃縮液10秒，吸取1μL加入膠液中。

3.震蕩后，室溫13000g離心10分鐘。

4.取一個新的pico芯片置于芯片盒（注意：肯定芯片盒的位置于C位）。

5.吸取9μL加染色液的膠，將槍頭置于芯片上標有“G”的 加樣井槽底（最下面的G槽），釋放膠液。

6. 將注射器的活塞拉至1ml的位置，接至芯片盒。

7. 關閉芯片盒。

8. 推進注射器活塞直至經過注射器的活塞固定栓，并保持位置。

9. 等30秒后拉動活塞固定栓，注射器活塞會緩慢回位。

10. 在等5秒后，緩慢將活塞拉回到1ml位置。

11. 打開芯片盒，翻轉芯片，檢查有沒有氣泡存在（應該沒有）。

12. 在另外兩個“G”槽中加入9μL膠液。

13. 吸取9μLRNA 6000 Pico 預處理緩沖液。

14. 注入標記有“CS”的小槽內。

15. 加5μL RNA 6000 Pico Marker 至所有將要加上樣樣品和Ladder的小槽內。

16. 加6μL RNA 6000 Pico Marker 至所有不需要加上樣樣品的剩下的小槽內。

17. 加1μL前面處理過的Ladder在標記有Ladder的小槽內。

18. RNA樣品70℃變性2分鐘，每個加樣小槽內加樣品RNA1μL。

19. 將芯片在專用震蕩器上于IKA2400震蕩標準震蕩1分鐘。

20. 運行Agilent2100 Bio分析軟件。

21. 緩慢將RNase 電極清洗芯片注入350μLRNase Away。

22. 將RNase電極清洗芯片放置入Agilent 2100 生物分析儀內。

23. 關閉分析儀，清洗電極1分鐘。

24. 緩慢將DEPC電極清洗芯片注入350μL DEPC水。

25. 將DEPC電極清洗芯片放置入Agilent 2100 生物分析儀內。

26. 關閉分析儀，清洗電極10秒鐘。

27. 打開分析儀，移去DEPC電極清洗芯片，等電極上的水蒸發10秒鐘。