四、操作步驟
(一)菌體培養及樣品的準備
1.菌體培養：以枯草芽孢桿菌為例。
培養基成分為：1％蛋白胨，0.5％氯化納，1％牛肉汁，調pH 至7.2。
將培養基裝入500mL 三角瓶內，每瓶100mL，滅菌，5.52×10Pa，30分鐘。滅菌后的培養基冷至約30℃，用接種環取菌株一環，接種于培養基內。搖床培養，30℃/22h。
收集菌體：將細菌連同液體培養基，4500r/min，離心10分鐘并用0.8％生理鹽水洗滌菌體兩次。
2.菌體細胞壁的提取
取3g 菌體，加20 mL 水，超聲處理10
min(功率150w)。將超聲處理后的懸液4000r/min，離心10分鐘，棄去沉淀(其中包含完整的細胞)，收集上清液，于15000g 離心15
min，棄去上清液，將沉淀物懸浮于5mL0.05mol/L 的pH7.6磷酸鹽緩沖液中，加RNA 酶，按0.5mg/mL
于37℃消化1小時。然后于25000g離心15min，棄去上清液，將沉淀物用水洗滌一次。再懸浮于5mL0.05mol/L
的pH7.6磷酸鹽緩沖液中，加胰蛋白酶(trypsin)0.5g/mL，于37℃消化3h。然后離心，棄去上清液，將沉淀用水洗滌3次，即得純凈的細胞，于冰箱內保存備用。
3.細胞壁的水解
取4g 細胞壁．放入安瓶管內，加入0.4mL2moL 的鹽酸，封口維持100℃，水解2小時。室溫冷卻，開管。用氫氧化鈉和濃硫酸做干燥劑，進行真空干燥。點樣前加0.1mL 水，將干燥的樣品溶解，用氨水調pH 至中性。
(二)樣品在硅膠H 薄層上的徑向層析
1.硅膠H 薄層板的制備
取 5cm×15cm 的玻璃板一塊，洗凈，烘干，放在水平臺面上。取1g 硅膠H，放在小研缽中，加
3.4mL0.5％羧甲基纖維素(CMC)溶液(起粘合作用)．加4~5滴95％乙醇(消除泡沫)，研磨數分鐘后，將研好的漿液倒在預先準備好的玻璃板上．用玻璃棒將漿液鋪開，再將玻璃板拿起稍加振動，使漿液分布均勻，放在水平臺面上，待水分蒸發后，置105℃烘箱中，活化30min。薄層厚度約為
0.25mm。
按照右圖中的圖形和規格，在硅膠H 薄層上用刀片刮去圖中陰影所示部位，使硅膠H 薄層上呈現一個細的頸部，此板即為徑向灣層層析板。徑向薄層層析的優點是，樣品展層后圖譜呈弧形帶狀，Rf 值相近的化合物也能清楚地分開。如此制作4~6塊薄層板，備用。
2.點樣
按照圖中所示點樣位置，將樣品及已知糖混合液分別點在兩塊薄層板上。點樣量約20～30μL，分次滴加．使點擴散后其直徑不超過5mm。點樣過程中．可用吹風機使樣品干燥，也可自然干燥。
3.展層
將點好樣品的薄層板置于密閉的容器或薄層層析缸中，用新配制的展開劑乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水＝12：3：3：2(體積比)，采用傾斜上行法，如圖3—4，將薄層板的下端浸在展開劑中0.3～0.5cm，展開劑借毛細管作用，經過硅膠H
層的細頸部，由下而上擴展。用此種形狀的薄層展開的時間較一般的薄層稍長，這是由于點樣處狹窄通過溶劑少的緣故。一般至展開劑距薄層板的上端約1cm時取出。放置通風處自然干燥，或用吹風機吹干。
圖3—4 傾斜上行展層法示意圖
1.玻璃蓋 2.薄層層析板 3.支撐物 4.層析缸 5.溶劑
4.顯色
在除去溶劑后的薄層上，進行噴霧顯色。噴霧時要求噴出的霧點細而均勻。糖的顯色劑種類很多，可根據實驗室的條件選擇使用。下面僅介紹三種顯色劑。
(1)苯胺—二苯胺—磷酸試劑：噴霧后于85℃烘烤10min，各種糖顯不同顏色。
(2)茴香醛—硫酸試劑：噴霧后于100～105℃烘烤至顯色，最低檢出量為0.05μg，各種糖顯不同顏色，此試劑對硼酸處理過的硅膠薄層顯色靈敏度較差。
(3)1，3—二羥基萘酚—硫酸試劑：在110℃預熱的薄層上噴霧，幾分鐘后在白色背景上顯出不同顏色的斑點，若是噴霧后再加熱，色點變深，底色也變深。
圖3—5 糖的徑向薄層層析圖譜(示意圖)
薄層：硅膠H1；顯色劑：本胺—二苯胺—磷酸試劑；展開劑：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2(v/v)
5.樣品中糖的定性鑒定：
薄層顯色后，參考顯色斑點的顏色，相對位置及Rf 值，Rf 值的定義是：從樣品層析的起點(原點)到層析斑點中心的垂直距離與從原點到溶劑流動的前沿的垂直距離的比值。
將樣品圖譜與標準圖譜相比較，確定樣品中含有那幾種糖，如圖3—5和表3—1，并根據觀察，用”十”、”十十”、”十十十”等表示各種糖的相對含量。
為得到確切的結果，應在相同條件下重復上述酶層層析實驗，應得到重復性的結果。
表 幾種糖的Rf 值及顏色。