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  • 發布時間:2020-09-07 20:19 原文鏈接: 純化凝膠選擇的具體方法(2)

    9.純化——包涵體蛋白

    包涵體蛋白往往需溶于6M鹽酸胍或8M尿素中。高化學穩定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝膠過濾介質很適合在變性條件下做純化。變性純化后的蛋白需要復性至蛋白的天然構象。Superdex 75、Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分別被發現有助包涵體蛋白的復性。一般包涵體蛋白樣品的純度越高,復性效果越好。SOURCE 30 RPC反相層析介質很適合純化復性前的粗品,并可以1MnaOH重生。此方法純化后的包涵體蛋白,復性回收率明顯提高。

    10.包涵體蛋白固相復性

    近年許多文獻報導將包涵體蛋白在變性條件下固定(吸附)在層析介質上,一般用各種Sepharose FF離子交換層析介質。去除變性劑后,蛋白在介質上成功復性,再將復性好的蛋白洗脫下來。固相復性避免了一般復性過程中蛋白質聚體的形成,所以復性得率更高,而且無需大量稀釋樣品,并將復性和初純化合二為一,大大節省時間及提高回收率。

    固相復性方法也被用于以HiTrap Chelating金屬螯合層析直接復性及純化包涵體形式表達的組氨酸融合蛋白;以HiTrap Heparin肝素親和層析直接復性及純化包涵體形式表達的含多個賴氨酸的融合蛋白。兩種親和層析預裝柱均可反復多次重復使用,比一般試劑盒更方便、耐用。

    11.純化——-中草藥有效成分

    中藥的化學成分極其復雜。傳統中藥多是煎熬后服用,有效成份多較為親水,包括生物堿、黃酮、蒽醌、皂甙、有機酸、多糖、肽和蛋白質。靈活及綜合性地利用多種層析方法。如離子交換、分子篩、反相層析,更容易分離到單一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝膠同時具備吸附性層析和分子篩功能,例:如用甲醇分離黃酮甙,三糖甙先被洗下來,二糖甙其次,單糖甙隨后,最后是甙元。 Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各種試劑,廣泛用于各種天然產物的分離,包括生物堿、甙、黃酮、醌類、內脂、萜類、甾類等。

    生物堿在酸性緩沖液中帶正電,成為鹽,HiTrap SP陽離子交換層析柱可以分離許多結構非常近似的生物堿。相反,黃酮、蒽醌、皂甙、有機酸等可溶于偏堿的緩沖液中,在HiTrap Q陰離子交換柱上分離效果良好。



    一般多糖純化大多使用分子篩如Sephadex,Sephacryl。若分子量在600KD以下,并需更高分辨率,可選擇新一代的 Superdex。一般植物可能含水溶性、酸溶性、堿溶性多種多糖。綜合利用分子篩及離子交換層析有助進一步獲各組份純品。另外,多糖藥物需去除可引起過敏的蛋白質,傳統Sevag方法用丁醇脫蛋白需反復數十次。陰陽離子交換法可以一、兩步快速去除多糖中殘存的蛋白質。SOURCE5、15、30RPC反相層析也很適合各種中藥有效成分的檢測、分離和放大制備。由于中藥的成分非常復雜,SOURCE反相層析可用范圍為pH1-14 ,并可用1M NaOH,1M HCL清洗、再生。比傳統硅膠反相層析更易于工藝優化及在位清洗,壽命也更長。

    12.純化-——肽類

    肽類的來源有天然萃取,合成肽和重組肽三種。肽容易被酶降解,但可從有機溶劑或促溶劑中復性,所以多以高選擇性的反相層析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或離子交換Minibeads、Monobeads作純化。Superdex Peptide HR是專為肽分子純化設計的凝膠過濾預裝柱,能配合反相層析做出更精美的肽圖。肽分子制備可用離子交換配合凝膠過濾Superdex 30 PG。

    13.純化——核酸、病毒

    核酸的純化用于去除影響測序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分為質粒DNA、噬菌體DNA和PCR產物等。病毒也可視作核酸大分子,和質粒 DNA一樣,可用分離大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝膠過濾介質去除雜蛋白,再配合離子交換如Mono Q、SOURCE Q分離核酸。

    14.純化——寡核苷酸

    寡酸苷酸多應用在反義(anti-sense)DNA、RNA測序、PCR和cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以陰離子交換的 Mono Q或快速低反壓的SOURCE Q在pH12下可除副產物,并避免凝集和保護基的脫落。載量大大高過反相層析,可用做大量制備。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除。


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