脂肪酸β氧化

實驗原理:
在肝臟中，脂肪酸經β-氧化作用生成乙酰輔酶A。2分子乙酰輔酶A可縮合生成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脫羧生成丙酮，也可還原生成β-羥丁酸。乙酰乙酸、β-羥丁酸和丙酮總稱為酮體。
本實驗用新鮮肝糜與丁酸保溫，生成的丙酮在堿性條件下，與碘生成碘仿。反應式如下：
2NaOH +I2─→NaOI +NaI +H2O
CH3COCH3 +3NaOI ─→CHI3（碘仿）+CH3COONa +2NaOH
剩余的碘，可以用標準硫代硫酸鈉滴定。
NaOI +NaI +2HCl ─→I2 +2NaCl +2H2O
I2 +2Na2S2O3─→Na2S4O6 +2NaI
根據滴定樣品與滴定對照所消耗的硫代硫酸鈉溶液體積之差，可以計算由丁酸氧化生成丙酮的量。
試劑和器材
一、試劑
0.1%淀粉溶液；0.9%氯化鈉溶液； 15%三氯乙酸溶液；10%氫氧化鈉溶液；10％鹽酸溶。
0.5mol/L丁酸溶液：取5 mL丁酸溶于100 mL0.5mol/L氫氧化鈉溶液中。
0.1mol/L碘溶液：稱取12.7g碘和約25g碘化鉀溶于水中，稀釋到1000 mL，混勻，用標準0.05mol/L硫代硫酸鈉溶液標定。
標準0.01mol/L硫代硫酸鈉溶液：臨用時將已標定的0.05mol/L硫代硫酸鈉溶液稀釋成0.01mol /L。

1/15mol/L pH7.6磷酸鹽緩沖液：1/15mol/L磷酸氫二鈉溶液86.8mL與1/15mol/L磷酸二氫鈉溶液13.2mL混合。
二、材料
新鮮豬肝。
三、器材
錐形瓶50mL（′ 2）;移液管5mL（′ 5），2mL（′ 45）；微量滴定管5mL（′ 1）;漏斗；恒溫水浴。
操作方法
一、肝糜的制備
稱取肝組織5g置于研缽中。加少量0.9%氯化鈉溶液，研磨成細漿。再加入0.9%氯化鈉溶液至總體積為 10mL。
二、β-氧化作用
取2個50mL錐形瓶，各加入3mL 1/15mol/L pH7.6磷酸鹽緩沖液。向其中一個錐形瓶中加入2mL正丁酸，另一個錐形瓶作為對照，不加正丁酸。然后各加入2mL肝組織糜。混勻，置于37℃恒溫水浴中保溫。
二、沉淀蛋白質
保溫1.5小時后，取出錐形瓶，各加入3mL15%三氯乙酸溶液，在對照瓶內追加2mL正丁酸，混勻，靜置15分鐘后過濾。將濾液分別收集在兩個試管中。
三、酮體的測定
吸取2種濾液各2mL分別放入另兩個錐形瓶中，再各加3mL0.1mol/L碘溶液和3mL10%氫氧化鈉溶液。搖勻后，靜置10分鐘。加入3mL10%鹽酸溶液中和。然后用0.01mol/L標準硫代硫酸鈉溶液滴定剩余的碘。滴定至淺黃色時，加入3滴淀粉溶液作為指示劑。搖勻，并繼續滴到藍色消失。記錄滴定樣品與對照所用的硫代硫酸鈉溶液的毫升數，并按下式計算樣品中的丙酮含量。
四、計算
肝臟中的丙酮含量（mmol/g）=（A-B）×C Na2S2O3×1/6
式中：A為滴定對照所消耗的0.01mol/L硫代硫酸鈉溶液的mL數；
B為滴定樣品所消耗的0.01mol/L硫代硫酸鈉溶液的mL數。
C Na2S2O3為標準硫代硫酸鈉溶液的濃度(mol/L)。
注意事項
肝糜必須新鮮，放置過久則失去氧化脂肪酸的能力。