表達蛋白的分離與純化

[實驗原理]

大腸桿菌表達蛋白以可溶和不溶兩種形式存在，需要不同的純化策略。現在，許多蛋白質正在被發現而事先并不知道它們的功能，這些自然需要將蛋白質分離出來后，進行進一步的研究來獲得。分析蛋白質的方法學現已極大的簡化和改進。必須承認，蛋白質純化比起DNA克隆和操作來是更具有藝術性的，盡管DNA序列具有異乎尋常的多樣性（因而它是唯一適合遺傳物質的），但它卻有標準的物理化學性質，而每一種蛋白質則有它自己的由氨基酸序列決定的物理化學性質（因而它具有執行眾多生物學功能的用途）。正是蛋白質間的這些物理性質上的差異使它們得以能進行純化但這也意味著需要對每一種待純化的蛋白質研發一套新的方法。所幸的是，盡管存在這種固有的困難，但現已有多種方法可以利用，蛋白質純化策略也已實際可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的獲得已是相當普遍的事。可誘導表達系統特別是Studier等發展的以噬菌體T7RNA聚合酶為基礎的表達系統的出現使人們能近乎常規地獲得過表達（overexpression），表達水平可達細胞蛋白的2%以上，有些甚至高達50%。

可溶性產物的純化

（融合T7?Tag的表達蛋白，采用T7? Tag Affinity Purification Kit）

[試劑準備]

1．T7?Tag抗體瓊脂。

2．B/W緩沖液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl， 0.137mM NaCl，1%吐溫-20，pH7.3。

4. 洗脫緩沖液: 0.1M檸檬酸，pH2.2。

5. 中和緩沖液：2M Tris，pH10.4。

6. PEG 20000。

[操作步驟]

1.100ml 含重組表達質粒的菌體誘導后，離心5000g×5min，棄上清，收獲菌體，用10ml預冷的B/W緩沖液重懸。

2. 重懸液于冰浴超聲處理，直至樣品不再粘稠，4℃離心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽濾后作為樣品液。

3. 將結合T7?Tag抗體的瓊脂充分懸起，平衡至室溫，裝入層析柱中。

4. B/W緩沖液平衡后樣品液過柱。

5. 10ml B/W緩沖液過柱，洗去未結合蛋白。

6. 用5ml洗脫緩沖液過柱，每次1ml，洗脫液用含150μl中和緩沖液的離心管收集，混勻后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。

7. 將洗脫下來的蛋白放入透析袋中，雙蒸水透析24hr，中間換液數次。

8. 用PEG 20000濃縮蛋白。

[注意事項]

1、蛋白在過層析柱前，要0.45μm膜抽濾或在4℃、10000rpm離心15min，否則幾次純化后，柱子中會有不溶物。

2、超聲處理后樣品可能會很粘稠，必要時可用DNA酶處理。

包涵體的純化

包涵體是外源基因在原核細胞中表達時，尤其在大腸桿菌中高效表達時，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質顆粒，在顯微鏡下觀察時為高折射區，與胞質中其他成分有明顯區別。包涵體形成是比較復雜的，與胞質內蛋白質生成速率有關，新生成的多肽濃度較高，無充足的時間進行折疊，從而形成非結晶、無定形的蛋白質的聚集體；此外，包涵體的形成還被認為與宿主菌的培養條件，如培養基成分、溫度、pH值、離子強度等因素有關。細胞中的生物學活性蛋白質常以可融性或分子復合物的形式存在，功能性的蛋白質總是折疊成特定的三維結構型。包涵體內的蛋白是非折疊狀態的聚集體，不具有生物學活性，因此要獲得具有生物學活性的蛋白質必須將包涵體溶解，釋放出其中的蛋白質，并進行蛋白質的復性。包涵體的主要成分就是表達產物，其可占據集體蛋白的40%～95%，此外，還含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂類及糖類物質，所以分離包涵體后，還要采用適當的方法（如色譜法）進行重組蛋白質的純化。

[試劑準備]

1．緩沖液A：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100mM NaCl。

2．緩沖液B：50mM Tris-HCl（pH8.0）,1mM EDTA,100 mM NaCl,1%NP-40。

3．緩沖液Ⅰ：50mM Tris-HCl （pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100(V/V),4M脲素。

4．緩沖液Ⅱ：50M Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,3% Triton X-100 。

5．緩沖液Ⅲ：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,2M 鹽酸胍。

6．緩沖液C：8M脲素，10mMβ-巰基乙醇，100 mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA及脫氧膽酸鈉。

[操作步驟]

1．用緩沖液A漂洗菌體細胞（10ml/g）, 離心6000g×15min，收集菌體細胞，重復此步驟，將菌體細胞再在緩沖液A中洗滌一次。

2．將漂洗過的菌體細胞懸浮于緩沖液B中，超聲破碎，鏡檢，破碎率高于95%，離心1500g×30min，收集包涵體沉淀。

3．將包涵體沉淀用緩沖液Ⅰ、緩沖液Ⅱ、緩沖液Ⅲ分別超聲洗滌一次，1500g 離心收集包涵體沉淀。

4．包涵體的溶解：用含高濃度脲素的緩沖液室溫放置30min，然后離心1500g×30min，留上清。將溶解后的蛋白質適當稀釋，磁力攪拌，透析過夜。

5．溶解后的包涵體蛋白可通過親和層析進一步純化。