表達蛋白（Expressedprotein）的分離與純化

大腸桿菌表達蛋白以可溶和不溶兩種形式存在，需要不同的純化策略。現在，許多蛋白質正在被發現而事先并不知道它們的功能，這些自然需要將蛋白質分離出來后，進行進一步的研究來獲得。
分析蛋白質的方法學現已極大的簡化和改進。必須承認，蛋白質純化比起DNA 克隆和操作來是更具有藝術性的，盡管DNA 序列具有異乎尋常的多樣性（因而它是唯一適合遺傳物質的），但它卻有標準的物理化學性質，而每一種蛋白質則有它自己的由氨基酸序列決定的物理化學性質（因而它具有執行眾多生物學功能的用途）。正是蛋白質間的這些物理性質上的差異使它們得以能進行純化，但這也意味著需要對每一種待純化的蛋白質研發一套新的方法。所幸的是，盡管存在這種固有的困難，但現已有多種方法可以利用，蛋白質純化策略也已實際可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的獲得已是相當普遍的事。可誘導表達系統特別是Studier 等發展的以噬菌體T7RNA 聚合酶為基礎的表達系統的出現使人們能近乎常規地獲得過表達（over-expression），表達水平可達細胞蛋白的2%以上，有些甚至高達50%。
一、可溶性產物的純化
（一）試劑準備
采用T7· Tag Affinity Purification Kit
1、T7·Tag 抗體瓊脂
（二）操作步驟
1、100ml 含重組表達質粒的菌體誘導后，離心5000g×5min，棄上清，收獲菌體，用10ml 預冷的B/W 緩沖液重懸。
2、重懸液于冰上超聲處理，直至樣品不再粘稠，4℃離心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽濾后作為樣品液。
3、將結合 T7·Tag 抗體的瓊脂充分懸起，平衡至室溫，裝入層析柱中。
4、B/W 緩沖液平衡后樣品液過柱。
5、10ml B/W 緩沖液過柱，洗去未結合蛋白。
6、用5ml 洗脫緩沖液過柱，每次1ml，洗脫液用含150μl 中和緩沖液的離心管收集，混勻后置于冰上，直接SDS-PAGE 分析。
7、將洗脫下來的蛋白放入透析袋中，雙蒸水透析24hr，中間換液數次。
8、用PEG 20000 濃縮蛋白。
（三）注意事項
蛋白在過層析柱前，要0.45μm 膜抽濾，否則幾次純化后，柱子中會有不溶物。
二、包涵體的純化
包涵體是外源基因在原核細胞中表達時，尤其在大腸桿菌中高效表達時，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質顆粒，在顯微鏡下觀察時為高折射區，與胞質中其他成分有明顯區別。包涵體形成是比較復雜的，與胞質內蛋白質生成速率有關，新生成的多肽濃度較高，無充足的時間進行折疊，從而形成非結晶、無定形的蛋白質的聚集體；此外，包涵體的形成還被認為與宿主菌的培養條件，如培養基成分、溫度、pH 值、離子強度等因素有關。細胞中的生物學活性蛋白質常以可融性或分子復合物的形式存在，功能性的蛋白質總是折疊成特定的三維結構型。包涵體內的蛋白是非折疊狀態
的聚集體，不具有生物學活性，因此要獲得具有生物學活性的蛋白質必須將包涵體溶解，釋放出其中的蛋白質，并進行蛋白質的復性。包涵體的主要成分就是表達產物，其可占據集體蛋白的40%～95%，此外，還含有宿主菌的外膜蛋白、RNA 聚合酶、RNA、DNA、脂類及糖類物質，所以分離包涵體后，還要采用適當的方法（如色譜法）進行重組蛋白質的純化。
（一）試劑配制
1、緩沖液A：50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）,2 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl。
2、緩沖液 B：50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）,1 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl，1%NP-40。

3．緩沖液Ⅰ：50 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），2 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，0.5%TritonX-100(V/V)，4 mol/L 脲素。
4．緩沖液Ⅱ：50 mol/L Tris-HCl（pH8.0），2 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，3% Triton X-100 。
5．緩沖液 Ⅲ：50 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），2 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，0.5%Triton X-100，2M 鹽酸胍。
6．緩沖液C：8 mol/L 脲素，10 mmol/Lβ-巰基乙醇，100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），2mmol/L EDTA及脫氧膽酸鈉。
（二）操作步驟
1．用緩沖液A 漂洗菌體細胞（10ml/g）, 離心6000g×15min，收集菌體細胞，重復此步驟，將菌體細胞再在緩沖液A 中洗滌一次。
2．將漂洗過的菌體細胞懸浮于緩沖液B中，超聲破碎，鏡檢，破碎率高于95%，離心1500g×30min，收集包涵體沉淀。
3．將包涵體沉淀用緩沖液Ⅰ、緩沖液Ⅱ、緩沖液Ⅲ分別超聲洗滌一次，1500g 離心收集包涵體沉淀。
4．包涵體的溶解：用含高濃度脲素的緩沖液室溫放置30min，然后離心 1500g×30min，留上清。將溶解后的蛋白質適當稀釋，磁力攪拌，透析過夜。
5．溶解后的包涵體蛋白可通過親和層析進一步純化。