微管蛋白的可溶性表達及純化

1、將重組質粒（BL21-2?2或Rossatta-2?2）的表達菌37℃搖培過夜后，1：20擴配（約需1h15m）；

2、至OD600=0.5~0.7時（約1h15min~1h45min），在 15-（0.5-24，0.8-12）；20-（0.5-12，0.8-8）；28、25-（0.8-8）進行蛋白誘導表達，具體條件根據搖床使用情況而定；

3、對誘導后的菌液4℃，4000g，20min，徹底去上清；離心前取2ml以備用于總蛋白電泳分析S1；

4、細菌沉淀用BindingBuffer（無尿素，20mM咪唑）懸浮，100ml用5~10ml緩沖液（約當2~5ml每克菌量），視懸浮后的菌液濃度而定；

5、反復凍融法破碎細胞：做到14步時由于時間原因不能立即繼續后面的操作，可將菌懸液放于-70℃冰箱中冷凍；也可用反復凍融的方法來破碎細胞，在-70℃凍融，在室溫下溶解，反復凍融3~4次；

6、加Lysozyme至1mg/ml（1ml加10ul），在冰上孵育30min~1h；

7、200~300W超聲破碎，2s×30次，停頓2s；若菌種較多可以增加破碎次數。注意超聲破碎時間，不可太長，否則溫度升高易導致蛋白變性；而時間太短則破碎不徹底，蛋白無法釋放出來；

注意：第7步可選作，若經過凍融及溶菌酶處理后的菌懸液比較澄清，則可不用超聲破碎。

8、4℃，10000rpm20~30min，取上清；將沉淀用變性的BindingBuffer（8M尿素）懸浮，然后室溫搖動30min，取 40ul進行電泳樣制備S2；

9、4℃，10000rpm10min，對上清再離心一次，取40ul進行電泳樣制備S3；

10、上清通過0.45um的細菌過濾器，取40ul進行電泳樣制備S4；

11、用HisTrap純化：

a）洗柱：用5倍柱床體積（5ml）純水洗柱，避免產生氣泡。

b）平衡：至少5mlBindingBuffer（20mM咪唑），一般10ml，流速在1ml/min。

c）上樣：流速要慢要，控制在1ml/min，并收集流出的蛋白液，取40ul進行電泳樣制備S5；

d）重新上樣：對第一次上樣流出的蛋白液再進行過柱一次，取40ul進行電泳樣制備S6；

e）平衡：用10mlBindingBuffer（20mM咪唑），收集第一管及最后一管，各取40ul進行電泳樣制備S7，S8。

f）洗脫：用5mlElutionBuffer（500mM咪唑）洗脫，每1ml一管，一般第一二管中蛋白多。

g）平衡：用5ml的BindingBuffer（20mM咪唑）平衡柱子；

h）封閉：用20%的乙醇封閉柱子，4℃保存。

若需進行咪唑濃度優化，則純化步驟改為：

10、4梯度咪唑濃度洗脫：依次用20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500mM的咪唑進行洗脫，每個濃度各用4ml，收集第2、3V；電泳分析后確定最佳的咪唑平衡及洗脫濃度。

12、樣品處理：吸取純化后的蛋白液40ul，加入10ul的5×的上樣緩沖液，100℃水浴5min，12，000rpm離心3min后取上清點樣，每個加樣孔15ul。

13、80V電泳2h左右，取出膠用染色液染色4~5h（回收的染色液可過夜），用脫色液脫色3次，觀察拍照。

附：

1、總蛋白電泳方法：700ul，12000g離心5min，棄上清，加入50霯1×蛋白上樣緩沖液，充分懸浮，煮沸5min，12000g離心 5min；

2、構建好的載體在進行蛋白誘導表達前，應選取10個左右的單克隆進行蛋白誘導的小量試驗，對誘導后的總蛋白進行電泳分析，選取表達量最大的克隆保存（甘油菌，-70℃冰箱）；

3、從-70℃冰箱中活化菌進行蛋白誘導表達試驗時，活化好的表達菌在4℃冰箱僅可存放15天左右，最多1個月，過期后必須重新劃線活化。4℃冰箱保存的宿主菌每次用過后必須用封口膜封好。

4、SDS-PAGE分析的蛋白樣：總蛋白樣S1，沉淀中的蛋白樣S2，離心后上清中的蛋白樣S3，過細菌過濾器后的蛋白樣S4，第一次上柱時流出的蛋白樣S5，第二次上柱時流出的蛋白樣S6，20mMBingdingbuffer過柱后的第一管S7和最后一管蛋白樣S8。