蛋白質含量的定量測定——雙縮脲法（Biuret法）

實驗原理

具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應。在堿性溶液中雙縮脲與銅離子結合形成復雜的紫好色復合物。而蛋白質及多肽的肽鍵與雙縮脲的結構類似，也能與Cu2+形成紫紅色絡合物，其最大光吸收在540nm處。其顏色深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質的分子量及氨基酸的組成無關，該法測定蛋白質的濃度范圍適于1~10mg /mL。雙縮脲法常用于蛋白質的快速測定。
紫紅色銅雙縮脲復合物分子結構為：
試劑和器材
一、試劑

雙縮脲試劑：取1.5g硫酸銅（CuSO4?5H2O）和6.0g的酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6 · 4H2O）溶于500mL蒸餾水中，在攪拌下加入300mL 10%NaOH溶液，用水稀釋至1000mL。此試劑可長期保存、備用。

二、標準和待測蛋白質溶液
標準蛋白溶液

10mg/mL結晶牛血清白蛋白溶液或相同濃度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配制）。作為標準用的蛋白質要預先用微量克氏定氮法測定蛋白質含量，根據其純度稱量，配制成標準溶液。
待測蛋白質溶液

人血清（稀釋10倍）。測試其他蛋白質樣品應稀釋適當倍數，使其濃度在標準曲線測試范圍內。

三、器材
試管1.5×15cm（×16），試管架，移液管1mL（×3）；5mL（×1）；恒溫水浴；分光光度計。
操作方法

一、制作標準曲線

取12支試管分成兩組，按下表平行操作：

蒸餾

取兩組測定的A540值的平均值，即A540為縱坐標，蛋白質濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

二、樣品測定

取4支試管分成兩組，按下表平行操作：

三、計算

取兩組測定的平均值計算：

血清樣品蛋白質含量（mg/100mL）=

其中,Y為標準曲線查得蛋白質得濃度（mg/mL），N為稀釋倍數，V為血清樣品所取的體積（mL），c為樣品原濃度（mg/mL）。

注意事項

（1）須于顯色后30min內比色測定。各管由顯色到比色的時間應盡可能一致。

（3）有大量脂肪性物質同時存在時，會產生渾濁的反應混合物，這時可用乙醇或石油醚使溶液澄清后離心，取上清液再測定。