原核表達操作步驟及注意事項

將克隆化基因插入合適載體后導入大腸桿菌用于表達大量蛋白質的方法一般稱為原核表達。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應用。大腸桿菌用于表達重組蛋白有以下特點：
易于生長和控制；用于細菌培養的材料不及哺乳動物細胞系統的材料昂貴；有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質粒可供選擇。但是，在大腸桿菌中表達的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達蛋白的生物學活性及構象。
表達載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達載體通常為質粒，典型的表達載體應具有以下幾種元件：
（1）選擇標志的編碼序列；
（2）可控轉錄的啟動子；
（3）轉錄調控序列(轉錄終止子，核糖體結合位點)；
（4）一個多限制酶切位點接頭；
（5）宿主體內自主復制的序列。
原核表達一般程序如下：
獲得目的基因－準備表達載體－將目的基因插入表達載體中（測序驗證）－轉化表達宿主菌－誘導靶蛋白的表達－表達蛋白的分析－擴增、純化、進一步檢測

一、試劑準備
1、LB培養基。
2、100mM IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm濾膜抽濾，-20℃保存。

二、操作步驟
（一）獲得目的基因
1、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環獲得所需基因片段。
2、通過RT- PCR方法：用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉錄形成cDNA第一鏈，以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物。
（二）構建重組表達載體
1、載體酶切：將表達質粒用限制性內切酶（同引物的酶切位點）進行雙酶切，酶切產物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2、PCR產物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
（三） 獲得含重組表達質粒的表達菌種
1、 將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，根據重組載體的標志（抗Amp或藍白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質粒，雙酶切初步鑒定。
2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆，重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。
3、 以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞。
（四）誘導表達
1、 挑取含重組質粒的菌體單斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃過夜培養。
2、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中, 37℃震蕩培養至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大約需3hr）。
3、取部分液體作為未誘導的對照組,余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續37℃震蕩培養3hr。
4、分別取菌體1ml, 離心 12000g×30s收獲沉淀，用100μl 1%SDS重懸，混勻, 70℃10min。
5、離心12000g×1min，取上清作為樣品, 可做SDS-PAGE等分析。

三 、注意事項
1、選擇表達載體時，要根據所表達蛋白的最終應用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達。
2、融合表達時在選擇外源DNA同載體分子連接反應時，對轉錄和轉譯過程中密碼結構的閱讀不能發生干擾。