外源基因在大腸桿菌中誘導表達與檢測

原理

目的基因被克隆到pET質粒載體上，受噬菌體T7強轉錄及翻譯(可選擇)信號控制；表達由宿主細胞提供的T7 RNA 聚合酶誘導。T7 RNA 聚合酶機制十分有效并具選擇性：充分誘導時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導表達后僅幾個小時，目的蛋白通常可以占到細胞總蛋白的50%以上。在培養體系中加入IPTG 誘導T7 RNA 聚合酶生產，繼而質粒上的目的DNA 開始轉錄。

本實驗采用已經構建好的表達載體pET，該載體帶有來源于古細菌的單鏈結合蛋白質（SSB）的序列，經IPTG的誘導，實現外源基因的表達，并通過SDS-PAGE對表達產物進行檢測。

一、主要儀器、材料、和試劑

1. 儀器

恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋，垂直板蛋白質電泳裝置，生化培養箱，電泳儀，超凈工作臺，移液器。

2. 材料

含有表達載體pET-28的BL21菌株。

3. 試劑

IPTG 儲液(200mg/ml)：在800μl 蒸餾水中溶解200mg IPTG 后，用蒸餾水定容至1ml，用0.22μm 濾膜過濾除菌，分裝于離心管并儲于-20℃。

二、操作步驟

1．重組質粒在大腸桿菌中的誘導表達

將已經驗證的帶有SSB－pET28重組質粒的大腸桿菌BL21在含有卡那霉素LB的平板上劃線培養。挑取長出的單菌落接入液體LB試管中，加入卡那霉素至終濃度為50ug/mL，37℃搖床過夜。按1％接種量接入100mL LB培養基，加入卡那霉素至終濃度為50ug/mL，37℃搖床培養至菌濃OD600達到0.6左右，加入IPTG至終濃度為1mM，37℃搖床繼續培養4h，誘導SSB蛋白表達。每隔兩個小時取樣進行實驗。

2. 蛋白質SDS—PAGE

在蛋白溶液中加入樣品緩沖液，100 oC處理5min，離心取上清5－15mL點樣。于75V～100V電泳約2h，凝膠在考馬斯亮蘭G250染液中染色1h，在脫色液中脫色。