瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是從瓊脂中提取出來的，是由D-半乳糖和3、6-脫水-L-半乳糖結合的鏈狀多糖，含硫酸根比瓊脂少，因而分離效果明顯提高。

瓊脂糖電泳具有以下優點：①瓊脂糖含液體量大，可達98％～99％，近似自由電泳，但樣品的擴散度比自由電泳小，對蛋白質的吸附極微；⑦瓊脂糖作為支持體有分辨率高、重復性好等優點；③電泳速度快；④透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測儀作定量測定；⑤區帶可染色，樣品易回收，有利于制備。缺點是瓊脂糖中有較多硫酸根，電滲作用大。

瓊脂糖凝膠電泳常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定、DNA限制性內切酶圖譜制作等，為DNA分子及其片段分子量測定和DNA分子構象的分析提供了重要手段。由于這種方法操作方便，設備簡單，需樣品少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用方法之一。

瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要依據它們的分子量及分子構型，同時與凝膠的濃度也有密切關系。

一、核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關系

1．DNA分子的大小：在凝膠中，較小的DNA片段遷移比較大的片段快。DNA片段遷移距離（遷移率）與其分子量的對數成反比，見圖4-7。因此通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離進行比較，便測出未知片段的大小。但是當DNA分子大小超過20kb時，普瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，應用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。

2．瓊脂糖的濃度：一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中，電泳遷移率不相同（圖3-3）。不同濃度的瓊脂糖凝膠適宜分離DNA片段大小范圍詳見表3-1。因而要有效地分離大小不同的DNA片段，主要是選用適當的瓊脂糖凝膠濃度。

二、核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關系

不同構型的DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差別較大。在分子量相當的情況下，不同構型的DNA的移動速度次序如下：共價閉環DNA（簡稱cccDNA）＞直線DNA＞開環的雙鏈環狀DNA。

三、瓊脂糖凝膠電泳基本方法簡介

1．凝膠電泳類型用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳也可分為垂直型及水平型（平板型）。水平型電泳時，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1~2mm，故又稱為潛水式。目前更多用的是后者，因為它制膠和加樣比較方便，電泳槽簡單，易于制作，又可以根據需要制備不同規格的凝膠板，節約凝膠，因而受到人們的歡迎。

表3-1瓊脂糖凝膠濃度與分辨DNA大小范圍的關系

2．緩沖液系統DNA的電泳遷移率受到電泳緩沖液的成分和離子強度的影響，當缺少離子時，電流傳導很少，DNA遷移非常慢；相反，高離子強度的緩沖液由于電流傳導非常有效，導致大量熱量產生，嚴重時，會造成膠熔化和DNA的變性。

常用的電泳緩沖液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，濃度約50mmol/L（pH7.5~7.8），詳細配制見表3-2。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時稀釋到所需倍數。

表3-2常用的瓊脂糖凝膠電泳緩沖液

3．瓊脂糖凝膠的制備

水平型：以稀釋的工作電泳緩沖液配制所需的凝膠濃度。

4．樣品配制與加樣DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖溶解液內含有0.25%溴酚藍或其他指示染料與10~15%蔗糖或10~15%甘油，以增加其比重，使樣品集中。

5．電泳瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結果表明：在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場強度增加時，分子量高的DNA片段遷移率的增加是有差別的。因此隨著電壓的增高，電泳分辨率反而下降，分子量與遷移率之間就可能偏離線性關系。為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場強度不宜高于5V/cm。

6．染色常用熒光染料溴乙錠（EB）進行染色以觀察瓊脂糖凝膠內的DNA條帶。