總DNA質量檢測及酶切

實驗目的：
了解掌握檢測 DNA 質量的方法以及 DNA 定量的方法；了解影響 DNA 在瓊脂糖凝膠中泳動速率的因素；訓練 DNA 的瓊脂糖凝膠電泳操作及 DNA 的限制性內切酶操作。

實驗原理：
限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP 的存在。Ⅰ類酶結合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA 分子,然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限制性內切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛應用，它們是重組DNA 的基礎。
絕大多數Ⅱ類限制酶識別長度為4 至8 個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列

實驗材料及試劑：
轉基因煙草總 DNA ，瓊脂糖，限制性內切酶 Dra I ， EcoRI ，EcoRV ， HindIII
實驗步驟：

1．取 10μl DNA 于 0.8% 凝膠檢測；

2．將 DNA 調節濃度至 300-400 ng/μl；

3．仔細閱讀將所用的任何一種酶產品說明書，熟悉反應條件及酶切的貯存濃度（ 10U-50U/μl ）廠家配套試劑；

4．計算據反應條件所需要的各種試劑準確用量：（ 0.5 ml tube 中）

DNA(3-5μg) 10μl

10 × buffer reaction 1.5μl

Enzyme (15 U/μl) 0.8μl （冰上）

ddH2O 2.7μl

混勻，短暫離心；

5．37 ℃ 溫浴 1-2 hrs ( 純 DNA) 或 10 hrs （粗制 DNA ）；

6．加入上樣緩沖液終止酶切反應，也可 65 ℃加熱 10 min 使酶變性失活；

7．電泳檢測酶切效率：

每個樣品取 1/10 量用瓊脂糖電泳檢測，制膠及點樣方法同上。

結果分析：

若水稻 DNA 呈現均勻連續分布的一片，則酶切效果好，否則需重做；

DNA 被切爛： DNA 降解，重新提 DNA ；

DNA 切不動：雜質多（多糖，蛋白質，酚類，有機溶劑等），重新純化；

若是 BAC 克隆 DNA ，酶切后應出現多條很清晰的不同大小 DNA 帶。