PCR產物克隆方法

平端連接

通常情況下，PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能在兩6條 DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產物成為3'突出一個堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR產物的效率通過較高，。在采用大量T4DNA連接酶并配以5—10uT4RNA連接酶時，可顯著提高其連接效率。對于較短PCR產物，用PUS19的HincⅡ位點進行克隆，以X－gal和IPTG篩選，常可得到足量重組子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將 PCR產物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆PCR產物。

粘端連接

引物中設計入限制酶位點：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互補堿基，因此可以在兩引物的5'末端設計單限制酶或雙限制酶切位點。這樣得到的 PCR產物用限制酶消化產生粘性末端，即可與有互補粘端的載體DNA重組。這種克隆方法效率較高，且當兩引物中設計不同酶切位點時，可有效地定向克隆 PCR產物。其缺點是需要加長PCR引物，除限制酶識別序列外，還需要在其5'端多合成3—4個堿基以利于限制性內切酶與PCR產物末端的穩定結合。即使如此，其酶切效率也不夠高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等較為難切。采用突變PCR方法可克服上述缺點。該方法是通過在兩PCR引物序列中改變 1至數個核苷酸創造出一個限制性內切酶位點。鑒于PCR引物的3'末端序列的互補性是PCR成功的關鍵，在PCR引物的中部或近5'端改變1個或幾個堿基對PCR擴增效果影響不大。這種方法不需要增加PCR引物的長度，而且酶切效果優于5'加端法。對于特定DNA片段的克隆，此方法較為經濟、實用。但對于基因診斷PCR產物的克隆，似乎5'加端法更為適宜。

T4DNA聚合回切產生粘端

如PCR兩引物的5'末端是A或T，則可在其5'端分別加上CG和CCGG。用此二引物擴增的PCR產物在dATP和dTTP存在的情況下，用 T4DNA聚合酶進行處理，則T4DNA聚合酶因具有3'→5'外切酶活性而消去3'末端的G和C，產生AccI和XmaI粘性末端（圖1）。此DNA片段直接與用AccI和XmaI切開的載體進行連接。這種方法只需在PCR引物的5'端加2—4個堿基，但其可選擇的限制酶類有限。

T－vector法

TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3'末端加一個堿基，所加堿基幾乎全是腺苷。據此，Marchuk等人采用3'端突出一個胸苷的質粒DNA 來克隆PCR產物，其克隆效率比平端的連接至少高出100倍。他們用EcoRV將pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的兩個3'末端各加一處胸苷。因為在4種dNTP都存在時，Taq聚合酶選擇性參入dATP，而當僅一種 dNTP存在時，它只能參入該種堿基。因此，在只加入ddTTP時，用TaqDNA聚合酶可使平端載體DNA轉變成3'末端突出一個胸苷的T尾載體，稱為 T－vector。用這種T－vectorsk可以較有效地直接克隆PCR產物。Hotton等人也報道了另一種制備T－vector的方法。他們使用脫氧核苷酸末端轉移酶在切成平端的載體DNA的3'末端加上一個胸苷。由于末端轉移酶可以催化多個堿基（ddTTP）作為底物，使平端載體DNA分子的兩個 3'末端各加上一個T。用這種方法制備的T－vector的不同之處在于前者3'末端不能與待克隆PCR產物的5'末端連接，僅5'末端可與PCR產物的 3'末端形成磷酸二脂鍵。

共環消解法：最近，Jung等人報道了一種有效的PCR產物克隆方法。用磷酸化的PCR引物擴增得到的PCR產物，先用T4DNA連接酶催化連接反應，使5'端帶有限制酶切位點的擴增DNA片段連接成共環結構。然后再用相應的限制酶進行消化，產生粘端DNA片段。對于對稱性限制酶位點，只需在引蛾的5'末端加上一關識別序列，因為在串接成共環后能恢復限制酶切位點難于切開的缺點，且可用于雙限制酶切位點的設計，只不過有PCR產物共環化后，僅約1/4的限制酶切點得以恢復。故此法較適用于單限制酶位點的克隆。

無連接酶亞克隆法(A)

無連接酶克隆法（ligase-free subcloning，LFS）是利用引物5’末端附加堿基修飾法，修飾堿基不是酶切位點，而是與某一質粒兩端分別互補的堿基。兩引物的3’端約20— 25個核苷酸分別與待擴增DNA兩翼互補，5’端各有約24個核苷酸分別與線性化質粒的3’端相同的附加序列。由于線性化質粒的3’端序列各不相同，PCR片段可以通過選擇各引物的合適5’附加序列與引物3’端定向雜交。

由此物a和b產生的兩端有附加序列的PCR產物與未反應引物分離后，分別加入兩只含有線性化質粒的反應管中進行第二次PCR。第1管中用引物a和 c，引物a即為第一PCR擴增的上游引物a，引物c為下游引物，與緊鄰5’端附加序列內測的質粒（+）鏈互補。同樣，第2管的引物為b和d，引物b與第一次PCR擴增的下游引物b相同，引物d為上游引物，與緊鄰5’附加序列內側的質粒（-）鏈互補。

第二次PCR的第一循環中，PCR產物與質粒均變性與復性。除自身復性產物（這種復性產物不被擴增）外，PCR產物與質粒可通過各自3’端互補序列雜交成部分異源雙鏈，延伸時，重疊的3’端互為此物沿各自互補鏈延伸，結果可產生PCR片段與線性質粒的“連接”。然后兩管中PCR擴增各進行15—20 個循環。這便可產生大量一端管1）或另一端連接有PCR插入片段的質粒。

第二次PCR后，將第1管與第2管反應液混合，用堿變性雙鏈，中和后稀釋變性的DNA。反應管中的單鏈DNA可以復性或幾種不同的產物，除各自本身復性產物外，管1產物ssDNA與管2中ssDNA可形成部分異源雙鏈DNA，并各自有一較長的5’或3’懸端，這種長的5’或3’懸端相互互補，在低 DNA濃度時可復性產生環化DNA。

盡管這種環化的DNA有兩個缺口，但它們可以直接用來轉化受體大腸直桿菌。一旦進入體內，兩個缺口便共價連接，修復的質粒即可復制，下面以從λ噬菌體DNA中擴增-500bp片段，并克隆入pGem4Z載體中為例說明LFS法。

這種方法同樣適于復雜基因組中基因片段的克隆。需注意的是第一次PCR時兩引物的5’附加序列不應太短以免影響第二次PCR時異源雙鏈的形成，以 24個核苷酸較為合適。擴增時若形成，引物二聚體，一定要去除，否則會嚴重影響轉化率。用LFS法已成功地克隆了長達1.7kb的基因片段。這種方法的優點是：①可用于常規方法無法進行亞克隆的片段；②適于任何PCR產物和任何質粒；③可亞克隆特殊目的（如含點突變、缺失或插入等）片段；④在某些情況下，對已構建了啟動子或增強子等序列的載體，可使待表達片段插入定向合適位置；⑤較快，可在1d內完成，較常規方法可靠，不需DNA連接酶。

DNA克隆是分子生物學的重要內容。特定基因的克隆常因兩端缺乏合適限制酶切點而受因，cDNA的克隆通常也效率不高、篩選因難。采用PCR技術行 DNA和cDNA的克隆，則可大大縮短克隆時間，比之全基因合成更為經濟和方便，因而愈來愈受重視。用PCR方法進行傳染性疾病和遺傳性疾病的診斷常遇到產物的異性問題和分型問題，采用產物克隆和測序方法，比之寡核苷酸探針雜交方法更為準確。隨著PCR技術的不斷發展和推廣，新的PCR產物的克隆方法也將不斷出現。