DNA重組實驗方法

[實驗原理]
DNA重組是將外源DNA與載體分子連接，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法。 重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。常用的DNA連接酶是T4噬菌體DNA連接酶，它不但能使粘性末端的DNA分子連在一起，而且能使平末端的雙鏈DNA分子連接起來，但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。
如果是單酶切，為了防止載體本身的自身連接，可以用牛小腸堿性磷酸酶（CIP）處理，去掉酶切后5'端的磷酸。這樣做能有效防止質粒的自身環化，降低轉化的背景，大大提高重組子的篩出效率。

連接反應的溫度在37℃時有利于連接酶的活性，但是在這樣的溫度下，粘性末端的氫鍵結合是不穩定的。一般的連接條件是在12-16℃，反應12-16小時 (過夜)，這樣既可最大限度地發揮連接酶的活性，又兼顧到粘性末端短暫配對結構的穩定。
連接產物轉化宿主細胞后，還須對轉化菌落進行篩選鑒定，挑選出所需的重組質粒。

[儀器、材料與試劑]
(一)儀器
1．恒溫搖床
2．恒溫水浴
3．恒溫培養箱
4．小型高速離心機

(二)材料
1． 氨芐青霉素
2． BamHI
3． HindIII
4． T4 DNA連接酶
5． pQE-31 和pUC18-CAT 質粒
6． 培養皿
7． 接種針
8． 金屬涂棒
9． 1.5mL 離心管
10．酒精燈
11．鑷子、滅菌牙簽等
(三)試劑
DNA瓊脂糖膠純化試劑盒（3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit，申能博彩公司）

[實驗步驟]
(一)質粒DNA
用實驗二提取的pQE-31和pUC18-CAT 質粒。
(二)制備重組DNA
1．在滅菌的1.5mL 離心管中，加入pQE-31質粒10mL(2mg／mL)，2mL酶切緩沖液，1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液（各含10個單位），無菌雙蒸水7mL，至反應混合物總體積為20mL，離心混勻，37℃反應過夜。
2．在另一無菌1.5mL 離心管中，加pUC18-CAT 質粒20mL，加入3mL酶切反應液，lmL BamHI和HindIII酶的混合液，無菌雙蒸水補到30mL，37℃反應過夜。
3．反應完畢后取5mL pQE-31質粒的酶切液做電泳分析，檢驗酶切是否完全。酶切完全，進行下一步。
4．將酶切處理的后pQE-31和pUC18-CAT 質粒，分別上樣跑瓊脂糖凝膠電泳（注意加DNA分子量標準）。電泳結束后用DNA瓊脂糖膠純化試劑盒按照試劑盒說明書的方法回收DNA片段。前者回收的片段為3.5kb，后者為650bp。
5．將回收的pQE-31載體質粒均分為兩份，其中一份與酶切后回收的CAT片段混合，做連接；另一份不加CAT片段，做對照。操作如下：

在10mL DNA樣品中, 加T4 DNA連接酶緩沖液1mL，T4 DNA連接酶1mL，14℃（室溫）過夜，然后做大腸桿菌的轉化。
(三)轉化感受態細胞
1．用實驗一制備的感受態細胞(-20℃保存的)。
2．在100mL的融化后處于冰浴的感受態細胞中，加入10mL連接產物，混勻，冰上放置30分鐘，以后的操作參照實驗一進行。同時做未加CAT片段的空白pQE-31載體質粒連接處理后的感受態細胞轉化的對照。
[實驗結果]
過夜培養后，實驗組和對照組的兩個培養皿上都可能會出現一些菌落。如果實驗組的菌落數明顯多于對照組的菌落，則是好征兆，但實驗組中出現的菌落是否含有所需的DNA重組子還須進一步鑒定。

附：試劑盒說明書

3S Spin DNA Agarose Gel purification Kit

試劑盒組成：

注：
(a)首次使用前，必須在Wash Solution 瓶中加入50ml無水乙醇，充分混勻后使用。每次
使用后將瓶蓋蓋緊，以保持Wash So1ution中的乙醇含量。
(b)TE pH8．0或者水均可以用于洗脫，測序樣品請用水洗脫。
試劑盒DNA回收率：
3S柱對100bp以上的DNA片段有較好的結合性能和回收率，回收率在60％以上。
主要用途：
(a)TBE或TAE Agarose膠中回收DNA片段。
(b)從溶液中回收和濃縮DNA，去除反應體系中的蛋白質。

操作步驟
從Agarose膠中回收DNA：
1．用Agarose膠電泳將目的DNA片段與其它DNA盡可能分開，然后用干凈的手術刀割下要回收DNA的瓊脂塊，放入1．5m1離心管中。判定DNA 片段的位置時，要盡可能使用長波長UV，在UV下照射的時間應盡可能短。
2．按每100mg Agarose膠加入400ml Solution SN，置于55-65℃水浴中5分鐘，中途混勻，至膠完全融化。膠融化后每400ml Solution SN加入100ml So1ution B，混勻。注意；高濃度的膠(1．5-2％)，每100mg膠加入500ml Solution SN，加熱融膠的時間延長到15分鐘，以保證膠全部融化，膠融化后加入100ml SolutionB，混勻。
3．將3S柱放入2m1收集管中，將融化的膠溶液轉移到3S柱中，讓蓋子開著，室溫放置2分鐘。蓋上離心管蓋(蓋子也可以不蓋，但是如果您同時有很多樣品，擔心混淆或弄翻溶液，建議您蓋上蓋子)，室溫離心(10，000rpm)1分鐘。
4．取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一個收集管中，加入600ml Wash Solution，室溫離心(10，000rpm)1分鐘。
5．重復步驟4一次
6．取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一個收集管中，室溫高速離心(10000 rpm)2分鐘。
7．將3S柱放入一根新的1．5m1離心管中，在3S柱子膜中央加入30ml TE或水，室溫放置2分鐘。注意：提高洗脫溫度有利于提高DNA的洗脫效率。也可以用預熱的TE或水洗脫。
8．蓋上離心管蓋(蓋子也可以不蓋，但是如果您同時有很多樣品，擔心混淆或弄翻溶液，建議您蓋上蓋子)，10，000rpm高速離心1分鐘，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃備用。

從溶液中回收和濃縮DNA：
1．根據溶液的體積和所要回收DNA的含量，加入5倍體積的Solution SN。如果溶液的體積不足100ml，加TE補足到100ml，再加500u1 Solution SN和100 ml SolutionB，混勻；
2．以下同從Agarose膠中回收DNA的步驟3-8。