第一節 轉化
基因片段在體外只是一段核酸分子，是化學物質，無法表現出遺傳物質的生命活性。只有當其存在于活細胞后，生命的特征才能充分展示出來。在分子克隆實踐中，在體外操作的核酸分子只有進入細胞以后才能達到克隆的目的。
一、重組DNA分子轉入原核生物細胞
1. 重組質粒DNA分子轉化大腸桿菌
轉化（transformation）——重組質粒DNA分子通過與膜蛋白結合進入受體細胞，并在受體細胞內穩定維持和表達的過程。
轉化不僅適合于大腸桿菌受體細胞，而且適合于枯草桿菌和藍藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受體細胞。
（1）CaCl2處理后的細菌轉化或轉染
A、制備感受態細胞
受體細胞的細菌，經一定濃度的冰冷的 CaCl2（50～100 mmol／L）溶液處理后變成。
所謂感受態細胞，處在感受態狀態的菌體有攝取各種外源 DNA的能力。
轉化：感受態的大腸桿菌細胞捕獲和表達質粒載體DNA分子的生命過程；
轉染：感受態的大腸桿菌細胞捕獲和表達噬菌體DNA分子的生命過程；
好的感受態細胞，每微克的超螺旋質粒DNA可得5×107個轉化體。
B、細胞轉化（或轉染）的具體操作過程：
① 將處于對數期的新鮮培養物于0℃4000轉/分離心10分，回收細菌細胞；
② 將細胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低滲溶液處理30分鐘，離心回收細胞，再用適量 0℃的0.1mol/L CaCl2重懸細胞，以誘導感受態產生。
③ 加入適量DNA，于42 ℃熱處理混合物90秒，使DNA分子被細胞吸收；
④ 將混合物快速轉到冰浴中，冷卻1~2分，加入適當的培養基，在37 ℃培養45分，使細胞復蘇并表達質粒所攜帶的轉化基因；
⑤ 通過選擇培養基上平板培養，選擇轉化體。
⑥ 如果用抗菌素篩選轉化體，作為對照的受體菌應該在此培養基上不生長。
（2）電穿孔轉化法
基本原理是利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細胞膜上進行電穿孔（electroporation），形成可逆的瞬間通道，從而促進外源DNA的有效吸收。
受體細胞的準備：當細菌生長到對數中期后予以冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降低細胞懸浮液的離子強度，并用10%甘油重懸細胞，使其細胞濃度為3×1010個／ml，分裝，在干冰上速凍后置于-70℃貯存。每小份細胞融解后即可用于轉化，有效期達6個月以上。
（3）三親本雜交接合轉化大腸桿菌
原理：是基于非接合型質粒的遷移作用（mobilization）而建立的一種DNA轉化方式。首先將具有接合轉化功能的輔助質粒轉移至含有重組質粒的供體細胞中，然后將這種供體細胞與受體細胞進行混合，促使兩者發生接合轉化作用，將重組質粒導入受體細胞。整個接合轉化過程涉及到3種有關的細菌菌株，即待轉化的受體菌、含有要轉化的重組質粒DNA的供體菌和含有廣泛宿主的輔助質粒的輔助菌，故稱三親本雜交接合轉化法。
尤其適用于那些難以采用Ca2+誘導轉化法或電穿孔法等進行重組質粒DNA分子直接轉化的受體菌。
（4）轉化率的計算及其影響因素
轉化率是指DNA分子轉化受體菌獲得轉化子的效率
有兩種表示方式：
A：以轉化子數與用于轉化處理的DNA分子數或質量的比率表示
B：以轉化子數與用于轉化處理的受體細胞數的比率表示。
以用于轉化處理的受體細胞數為基數來計算轉化率
A：通過菌液OD值測定或細菌計數，計算出用于制備感受態細胞的受體菌總數。
B：計算轉化子與受體菌的比率。
用于制備感受體細胞的菌液每毫升有5×107個菌體，則4
ml菌液有2×108個菌體，由此菌液制備成感受態細胞，通過轉化處理，獲得1000個轉化子，則轉化率是103／（2×108）＝5×10-6。其含義是每個受體菌細胞被轉化的概率是5×10-6，或者說，要得到一個轉化子，需要2×105個受體菌細胞。
每單位質量的DNA分子獲得的轉化子數來表示
單位通常是轉化子數每μg DNA分子，如每μg重組DNA分子獲得106個轉化子，則轉化率為106個/ μg DNA分子。
影響轉化率的因素：
分子量
載體類型及構型
重組DNA分子的濃度與純度
受體細胞
2. 重組λ噬菌體DNA子轉導大腸桿菌
轉導（transduction）是指通過λ噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細胞的途徑把外源DNA分子轉移到受體細胞內的過程。λDNA與外殼蛋白結合成噬菌體顆粒，才有轉導宿主大腸桿菌的能力。因此重組的λDNA必須進行體外包裝。所謂體外包裝，是指在體外模擬λ噬菌體DNA分子在受體細胞內發生的一系列特殊的包裝反應過程，將重組λ噬菌體DNA分子包裴為成熟的具有感染能力的λ噬菌體顆粒的技術。
在實驗方法上，體外包裝包括兩個方面：（1）包裝抽提物的制備；（2）體外包裝過程。