當雙鏈DNA 分子的一條鏈上產生切口時,E.coli DNA
聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。同時該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性,能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補上核苷酸,從而使切口沿著DNA
鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。切口平移反應受幾種因素的影響:
(a) 產物的比活性取決于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b) DNA 酶Ⅰ的用量和E.coli DNA
聚合酶的質量會影響產物片段的大小。(c) DNA 模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性, 故應使用仔細純化后的DNA 。
材料： 待標記的DNA 。
設備： 高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)10×切口平移緩沖液:0.5mol/L Tris?Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。
(2)未標記的dNTP原液:除同位素標記的脫氧三磷酸核苷酸外,其余3種分別溶解于50mmol/L Tris?Cl (pH7.5)溶液中,濃度為0.3mmol/L。
(3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。
(4) E.coli DNA 聚合酶Ⅰ(4單位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L Tris?Cl(pH7.5)中。
(5)DNA 酶Ⅰ:1mg/ml。
(6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。
(7)10mol/L NH4Ac。
操作步驟:
(1) 按下列配比混合:
未標記的dNTP 10μl
10×切口平移緩沖液 5μl
待標記的DNA 1μg
[α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl
E.coli DNA 聚合酶 4單位
DAN酶 I 1μl
加水至終體積 50μl
(2) 置于15℃水浴60分鐘。
(3) 加入5μl EDTA終止反應。
(4) 反應液中加入醋酸銨,使終濃度為0.5mol/L, 加入兩倍體積預冷無水乙醇沉淀回收DNA 探針。