㈣ DNA聚合酶
如前所述，選用合適的DNA聚合酶進行測序反應也是保證測序質量的重要因素之一。常用于雙脫氧末端終止法測序的有幾種不同的酶：
1．大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）
此酶是最早用于建立Sanger測序的酶。但通常會有兩個問題：①Klenow片段的持續合成能力較低，通常只能得到約250~350個核苷酸的序列，而且由于聚合酶隨機從模板上解離而終止鏈延伸，通常會產生較高的本底和假帶；②對同聚核苷酸段或其他含牢固二級結構的區域復制效能低下。但此酶價格便宜，對已知序列的亞克隆進行鑒定仍有應用價值。
2．測序酶（sequenase）
該酶是一種經過化學修飾的T7噬菌體DNA聚合酶，其原來很強的3′→5′外切酶活性，經化學修飾后大部分被消除。目前常用的測序酶大都是基因工程產品，完全缺失3′→5′外切酶活性，具有活性非常穩定可靠、持續合成能力強和聚合速度高等優點，是測定較長DNA的首選酶。市售的各種以該酶為基礎的測序試劑盒，效果甚佳。
3．耐熱DNA聚合酶
PCR技術的應用正在不斷擴大，耐熱DNA聚合酶應用于以Sanger雙脫氧鏈終止法為基礎的DNA測序方案，已發展成為被稱為“循環測序”或“線性擴增測序”方法。在該類測序方法中，由于使用了耐熱DNA聚合酶，與其他DNA聚合酶相比較具有二大優點。其一，由于采用熱循環方法線性擴增模板DNA，獲得清晰可辨的序列梯帶所需要的模板DNA量少；其二，由于，耐熱DNA聚合酶可在95℃高溫下保持穩定，測序反應可以在高溫（70~80℃）下進行。因而能克服富含GC序列的模板形成自身二級結構對測序的影響。因此，循環法可以方便地對PCR產物、質粒DNA、λDNA和粘粒DNA等雙鏈模板進行序列測定，特別有利于對高GC堿基含量的模板測序。
循環測序法利用了熱循環儀的自動循環的高效能力。循環測序反應與普通PCR反應有所不同。只需一條引物，通過單引物進行熱循環，模板DNA以線性方式被擴增，而不是標準PCR的指數方式擴增；反應底物除四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）外，還加入了雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），進行擴增時，鏈的延伸終止于摻入ddNTP的位置，產生分別終止于不同核苷酸的一系列不同長度的擴增片段。
㈤ 放射性標記
傳統的DNA測序方法都采用α-32P-dNTP作為放射性標記物，但由于32P發射的高能β射線，常會引起二個問題。首先是導致放射自顯影圖譜條帶擴散、分辨率低，限制了識讀序列的數量和準確性。其次是32P衰變會導致DNA樣品分解，通常都應在測序反應后24h內進行電泳，否則無法獲得好的結果。
近年來α-35S-dNTP被廣泛采用，是由于35S產生較弱的β射線，克服了32P的二大缺點。放射自顯影圖譜具有較高的分辨率和較低的本底，測序反應產物可在-20℃保存一周，而分辨率并不下降。
㈥ 關于DNA序列的識讀
DNA序列的識讀是一個熟能生巧的過程。注意幾點技巧：①在顯影前后一定要注意標明模板名稱、日期和測序人等，并標明各套反應位置；②識讀時從顯而易見的特征序列開始，如連續的同聚核苷酸（如TTTTT、AAAAA）或交替出現的嘌呤和嘧啶（如GTGTGTGT），一旦找到這種序列，便可較快地確定目的序列的位置。
二、Maxam-Gilbert化學降解法測序
幾乎在雙脫氧法發展的同時，1977年Maxam-Gilbert等提出了化學降解法。自Maxam-Gilbert初次提出以來，其實驗方案基本上沒有變化。
㈠ 原理
化學降解法與包括合成反應的鏈終止法不同，需要對原DNA進行化學降解。其基本原理是，首先對待測DNA末端進行放射性標記，再通過5組（也可以是4組）相互獨立的化學反應分別得到部分降解產物，其中每一組反應特異性地針對某一種或某一類堿基進行切割。因此，產生5
組（或4組）不同長度的放射性標記的DNA片段，每組中的每個片段都有放射性標記的共同起點，但長度取決于該組反應針對的堿基在原樣品DNA分子上的位置。此后各組反應物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，通過放射自顯影檢測末端標記的分子，并直接讀取待測DNA片段的核苷酸序列。測序原理如圖7-19所示。
圖7-19化學裂解法測序原理
㈡ 待測DNA的末端標記
化學降解法測序首先要制備單側末端標記的待測DNA片段。DNA片段的核素標記有三種方法：
1．利用T4噬菌體多核苷酸激酶和γ-32P-ATP標記DNA的5ˊ-末端
對于去5′-磷酸化的DNA片段，T4噬菌體多核苷酸激酶可以通過正向反應將γ-32P-ATP的γ-磷酸基轉移至DNA的5ˊ-末端；對于5′-磷酸化的DNA片段，在過量ATP條件下，該酶可以通過交換反應將γ-32P-ATP的γ-磷酸基與DNA的5ˊ-末端磷酸基發生交換反應而標記。但對于雙鏈DNA片段，由于DNA的兩側均被標記，不能直接用于測序反應。需要經限制性內切酶切割，電泳分離二種不同大小的標記片段，或者直接用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離二條單鏈，但這種分離方法比較困難，較少使用。