核酸和蛋白質序列分析2

（2）輸出：除了以文本形式外，還可以通過JalView顯示和編輯結果。此外，還可以另外使用GeneDoc（常見于文獻）及DNAStar軟件等顯示結果。多序列比對的結果還用于進一步繪制進化樹。

3、ORF(Open Reading Frame)分析

從核酸序列翻譯得到蛋白質序列，需要進行ORF分析，每個生物信息學分析軟件包幾乎都帶有翻譯功能。推薦使用NCBI的ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）軟件或EMBOSS中的 getorf（http://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/）軟件。ORF Finder 以圖形方式，分為正鏈+1、＋2、＋3和反鏈＋1、＋2、＋3六個相位預測ORF；Getorf可指定預測ORF的長度下限和指定預測正反鏈。進行ORF 分析雖然比較簡單，但應注意以下幾點：

（1）序列的準確性：尤其是通過計算機拼接的序列，需要根據EST和基因組序列進行反復校正。

（2）ORF是否完整：看在ORF上游同一相位是否具有終止碼，或者具有起始密碼子。

（3）參考Kozak一致性規律，即起始密碼子位點符合A/GCCATGG。

（4）不要忽略反義讀框。

4、染色體定位

根據基因組圖譜對序列進行染色體定位和瀏覽其基因組上下游基因。具體方法為：（1）進行Genomic BLAST搜索。（2）通過“Genome view”觀察基因組結構。（3）點擊相應染色體區域，通過表意圖（ideogram）和相應區域上下游的基因進行精確定位。

5、基因結構分析

根據基因的mRNA序列及基因組序列，可以進行基因結構的分析。推薦使用BLAST或BLAT(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) 進行分析。由于真核生物轉錄后內含子將被剪切，因此將mRNA和基因組進行比對以后，會發現mRNA的每個外顯子與基因組序列片斷匹配，根據這些片段可以判斷外顯子的數目和大小。外顯子和內含子具體邊界的確定，可以參考GT/AG一致性規則。BLAT的結果直接顯示外顯子數目、大小及邊界。

6、基因上游調控區分析

（1）啟動子預測：推薦使用冷泉港開發的FIRSTEF程序（http://rulai.cshl.org/tools/FirstEF/）進行啟動子預測。用RT-PCR等實驗方法獲得的mRNA往往缺少完整的 5’端，采用FirstEF 程序可以對第一外顯子（尤其是非編碼的第一外顯子）和CpG相關啟動子進行預測。

方法：以FastA格式輸入起始密碼子上游序列。

（2）轉錄因子結合位點分析：推薦使用TFSEARCH程序（http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html）及MATCH程序

（http://www.gene-regulation.com/pub /programs.html#match）對轉錄因子數據庫TRANSFAC（http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/）進行搜索，尋找可能的轉錄因子結合位點。

方法：輸入起始密碼子上游序列。結果將給出很多可能的轉錄因子結合位點，注意選擇其中分值較高的位點。

（二） 蛋白質序列分析

1、跨膜區預測

各個物種的膜蛋白的比例差別不大，約四分之一的人類已知蛋白為膜蛋白。由于膜蛋白不溶于水，分離純化困難，不容易生長晶體，很難確定其結構。因此，對膜蛋白的跨膜螺旋進行預測是生物信息學的重要應用。

推薦使用TMHMM軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對蛋白進行跨膜預測。TMHMM綜合了跨膜區疏水性、電荷偏倚、螺旋長度和膜蛋白拓撲學限制等性質，采用隱馬氏模型（Hidden Markov Models），對跨膜區及膜內外區進行整體的預測。TMHMM是目前最好的進行跨膜區預測的軟件,它尤其長于區分可溶性蛋白和膜蛋白，因此首選它來判定一個蛋白是否為膜蛋白。所有跨膜區預測軟件的準確性都不超過52％，但86％的跨膜區可以通過不同的軟件進行正確預測。因此，綜合分析不同的軟件預測結果和疏水性圖以獲得更好的預測結果。

方法：輸入待分析的蛋白序列即可。

2、信號肽預測

信號肽位于分泌蛋白的N端，當蛋白跨膜轉移位置時被切掉。信號肽的特征是包括一個正電荷區域、一個疏水性區域和不帶電荷但具有極性的區域。信號肽切割位點的-3和-1位為小而中性氨基酸。

推薦使用SignalP軟件2.0版（http://www.cbs.dtu.dk /services/SignalP-2.0/）對PDCD5N端序列進行信號肽分析。SignalP2.0根據信號肽序列特征，采用神經網絡方法或隱馬氏模型方法，根據物種的不同，分別選擇用真核和原核序列進行訓練，對信號肽位置及切割位點進行預測。信號肽切割位點預測用Y-score maximum來判斷，對是否分泌蛋白用mean S-score來判斷：如果mean S-score大于0.5，則預測為分泌蛋白，存在信號肽，但II型跨膜蛋白的N端序列可能被錯誤預測為分泌蛋白的信號肽。

方法：輸入待分析的蛋白序列，如為原核基因選擇原核訓練集，否則選擇真核訓練集。

3、亞細胞定位預測

亞細胞定位與蛋白質的功能存在著非常重要的聯系。亞細胞定位預測基于如下原理：（1）不同的細胞器往往具有不同的理化環境,它根據蛋白質的結構及表面理化特征,選擇性容納蛋白。（2）蛋白質表面直接暴露于細胞器環境中,它由序列折疊過程決定,而后者取決于氨基酸組成。因此可以通過氨基酸組成進行亞細胞定位的預測。

推薦使用PSORT（http://psort.nibb.ac.jp/）II 軟件對PDCD5蛋白的細胞內定位進行預測。PSORT將動物蛋白質定位于10個細胞器：（1）細胞漿，（2）細胞骨架，（3）內質網，（4）胞外，（5）高爾基體，（6）溶酶體，（7）線粒體，（8）胞核，（9）過氧化物酶體（peroxisome）和（10）細胞膜。