報告基因被廣泛地應用于細胞生物學中的基因表達和細胞相關內容的研究。常用的報告基因主要有GUS基因、CAT基因、hGH基因、Cato2ase基因、綠色熒光蛋白基因及螢火蟲熒光素酶基因等。在這些報告基因中螢火蟲熒光素酶基因因其表達產物-熒光素酶敏感性高,測定方法快速且宜于掌握,線性好,并且熒光素酶產生的光產物是在已知的化學光敏反應中產生光量子最高的,熒光素酶是一蛋白質單體(61KD),對酶活而言,不需要次級轉錄過程。因此,熒光素酶基因能夠作為轉錄研究中的一類重要的報告基因。Promega公司的熒光素酶分析系統允許熒光素酶的更大折疊,從而產生了持續幾分鐘的高的光密度。利用Promega公司熒光素酶分析系統產生持續光密度,使得自動注射裝置成為非必需品。簡單的分析過程適用于不同的測量設備,例如用閃爍計數器或攝影膠片。熒光酶分析系統在8個量值上是線性的,甚至少于10-20摩爾的熒光素酶在理想條件下就能檢測到。通常,用戶能夠獲得比氯霉素乙酰轉移酶分析系統大100倍的光密度。
一:儀器:
控溫儀、熒光檢測器
二:試劑:
熒光素酶分析系統試劑盒PBS緩沖液(不含Mg2+Ca2+)
熒光素酶分析底物
熒光素酶分析緩沖液
5×細胞培養裂解液
三:操作:
1.加4倍體積的水于1體積的5×細胞裂解液試劑中,使最終濃度成為1×,平衡1×試劑并使熒光素酶分析試劑至室溫。
2.去除培養基,并用PBS緩沖液仔細洗滌細胞兩次,不能丟失細胞。
3.用1×細胞裂解液試劑覆蓋細胞(最小體積)。
4.將附著在培養基上的細胞刮下,將溶解的細胞轉移到微量離心管中12,000×g下5秒。
5.將20ul室溫下的細胞提取物與100ul熒光素酶分析試劑混合。
6:酶活性檢測
注意:
1:冷凍熒光素酶分析試劑不能在25℃以上溶化,且剛溶化的試劑必須混合后才能使用。
2:熒光素酶最適反應溫度為室溫,且酶活性在室溫下可穩定存在數小時,但熒光量子反應半衰期為5分鐘。
3:對于植物組織,用液氮快速冷卻,將組織磨成粉末,在室溫下用1×緩沖液懸浮。離心以后去碎片,用標準條件測量。
4:對于細菌,將40ul的細菌與50ul的轉移液混合,加入10ul的1MK2HPO4,
pH7.8,20mM的EDTA。用干冰快速冷凍混合物,然后在室溫水中用試管將混合物平衡至室溫。加入300ul新鮮制備的裂解混合物,(1體積的新鮮裂解物加入2體積的2×細胞裂解試劑,5mg/mlBSA)混合物及培養的細胞在室溫下放置10分鐘。最終試劑濃度為1×細胞裂解液,2.5mg/ml
BSA, 1.25mg/ml溶菌酶。