大腸桿菌感受態制備與質粒轉化

主要試劑
1、LB培養基（滅菌后使用）
胰蛋白胨（bacto-tryptone） 10g/L
酵母提取液（bacto-yeast extract） 5 g/L
NaCl 10g/L
用NaOH調pH至7.0。

2、LB固體平板
每升液體培養基中加入15g瓊脂粉，高壓滅菌后倒入滅過菌的培養皿中。
3、SOC培養基
20g/L Tryptone
5g/L Yeast extract
0.58g /L NaCl
0.186g /LKCl，滅菌后加入過濾除菌的2M葡萄糖（終濃度為20mM），1M MgCl2（終濃度為10mM）。
5.0.1M CaCl2（滅菌后使用）
6. 0.1M CaCl2+10%甘油
7. 保存于-80℃冰箱的DH5α 或DH10B甘油菌

主要儀器
恒溫搖床
冷凍離心機　
實驗步驟
一 、 熱擊感受態細胞的制備及熱擊轉化
1、細菌培養
1） 從平板上挑取大腸桿菌（DH5α或DH10B）單菌落，放到LB培養基中。（液體培養基的體積為溶液容積的1/3-1/4為宜）。
2） 在37℃，220 rpm培養10h左右。
3） 中吸取2 mL培養液到裝有200 mL LB培養基的三角瓶中，37℃，220 rpm培養2-3hrs，使其OD600達0.5-0.6。
2、細菌收集
將培養液倒入預冷的50 mL離心管中，置于冰上。3000 rpm離心5-10min。
3、感受態制備
1） 倒棄上清后，加入適量（20mL左右）的預冷的0.1M CaCl2，懸浮菌體，冰上放置30 min。
2） 4000 rpm離心5-10min，倒棄上清后再加入適量（20mL左右）的預冷的0.1M CaCl2，懸浮菌體。
3） 4000 rpm離心5-10 min，加入少量0.1M CaCl2+10%甘油懸浮菌體。
4、感受態保存
將上述感受態細胞分裝于0.5 mL Eppendorf管（100mL/管）中，置于-70℃貯存備用。
5、感受態融化
從冰箱中取出制備好的感受態細胞，放在冰上，使其融化。并將準備好的質粒也放在冰上。
6、轉化
在一個預冷的0.5mL Eppendorf管中加入100 μL感受態細胞和1μL質粒，混勻，置于冰上30min。42℃，90S后立即移至冰上。
7、 轉化物液體培養
將轉化后的混合物轉至含有1mL SOC培養基的離心管中，37℃、200 rpm培養1h。
8、涂板與培養
取100 μL培養液，均勻涂布于LB 平板上。
LB 平板置于37℃培養箱過夜培養。培養好的平板放入4℃冰箱。
　
二、 電擊感受態細胞的制備及轉化
1、細菌培養
1）從平板上挑取大腸桿菌（DH5α或DH10B）單菌落，放到LB培養基中。（液體培養基的體積為溶液容積的1/3-1/4為宜）。
2）37℃，220 rpm培養10 h左右。
3）從中吸取2 mL培養液到裝有200 mL LB培養基的三角瓶中，37℃，220 rpm培養2-3 h，使其OD600達0.8-1.0。
2、細菌收集
將培養液倒入預冷的50mL離心管中，置于冰上。3000 rpm離心5-10min。
3、甘油處理細胞
棄上清（倒干凈）后，加入適量（20 mL左右）的預冷的10%甘油，懸浮菌體。
4、細胞保存
3000rpm離心5-10 min，倒棄上清后再加入少量10%甘油懸浮菌體。將上述菌液分裝于0.5 mL Eppendorf管中，置于-70℃貯存備用。
5、感受態融化
從冰箱中取出制備好的感受態細胞，放在冰上，使其融化。并將準備好的質粒也放在冰上。
6、轉化
在一個預冷的0.5mL Eppendorf管中加入100 μL感受態細胞和1μL質粒，混勻，置于冰上。連接好電擊儀，電擊杯預冷。將待擊混合液加到電擊杯兩電極之間（不能有氣泡），380V電擊。
7、轉化物液體培養
將轉化后的混合物轉至含有1mL SOC培養基的離心管中，37℃、200rpm培養1h。
8、 涂板與培養
取5 μL培養液，均勻涂布于LB 平板上。
LB 平板置于37℃培養箱過夜培養。培養好的平板放入4℃冰箱。
　
實驗結果
在含Amp的LB平板上將看到若干白色的菌落，即是陽性克隆。　

如果未出現陽性克隆，則可能是感受態細胞活性太低，或轉化的效率太低。

注意事項
1、在所有的實驗中要注意嚴格無菌操作。
2、所用耗材滅菌后使用。
3、感受態細胞不能放在常溫下放置；必須在超低溫下保存。
4、轉化過程要嚴格控制時間和溫度

相關知識
轉化（transformation)：使受體細胞從周圍介質中吸收外來DNA分子，從而獲得新的遺傳物質的過程就是轉化。
感受態細胞（competent cell)：用于轉化的細菌稱為感受態細胞，它是指細菌細胞處于一種最易吸收外來DNA的狀態。
載體（vector)：用于攜帶重組DNA，并能夠使外源DNA能復制與表達的運載工具。
世界上現在使用較多的質粒載體主要有pBR322系列、pUC系列（如pUC18、pUC19、pUC118、pUC119）、M13系列、pSP系列、pGEM系列等。
pGEM-T easy載體是將pGEM-Zf（+）用EcoRV在其兩端加上“T”，這有利于PCR產物的克隆，因為PCR反應結束時，Taq酶會在PCR產物的末端加上一個“A”。pGEM-T easy載體全長3015bp，含有多個限制性內切酶位點。限制性內切酶位點的兩側有T7、SP6 RNA聚合酶啟動子位點，并且含有M13正、反向序列（如圖）。pGEM-T easy載體作為一種商品化的載體存在幾個優點：
（1） 與PCR產物連接效率較高。
（2） T7、SP6、M13位點有利于插入片段序列的測定。
（3） M13序列有利于插入序列的PCR擴增。
（4） 其兩端都存在EcoRI酶切位點，使得插入序列酶切極為方便。
（5）含有LacZ基因，含重組質粒的菌落用藍白斑鑒定。