大腸桿菌感受態細胞的制備

實驗原理感受態就是細菌吸收轉化因子的生理狀態，只有發展為感受態的細胞才能穩定攝取外來的DNA分子。受體細胞經過一些特殊方法（如：電擊法，CaCl2等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發生變化，成為能容許帶有外源DNA的載體分子進入的感受態細胞。

目前常用的感受態細胞制備方法有CaCl2 法，簡便易行，且其轉化效率完全可以滿足一般實驗的要求，制備出的感受態細胞暫時不用時，可加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法為使用更廣泛。

一、材料

大腸桿菌 E.coli DH5α，100ml三角瓶，1.5ml 離心管(又稱eppendorf管), 離心管架，1000 ul 、200ul槍頭，大量冰塊，

二、設備

微量移液器(200μl,1000μl)，高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)，恒溫搖床、冷凍離心機, 超凈工作臺, 紫外光度計，雙蒸水器，冰箱等。

三、試劑準備

1、LB液體培養基：稱取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10 g，溶于800ml蒸餾水中，用NaOH調pH至7.5, 加水至總體積1升，高壓下蒸氣滅菌15分鐘。

2、LB固體培養基：液體培養基中每升加12g瓊脂粉，高壓滅菌。

3、高壓滅菌的0.1mo1／L CaCl2：母液1M CaCl2147 g CaCl2 2H2O，加水到1L

4、高壓滅菌過的30％甘油

四操作步驟

大腸桿菌感受態細胞的制備

（1） （已預先準備好）從新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一單菌落（超凈工作臺操作），接種于3～5ml LB液體培養中，37℃振蕩培養12h左右，直至對數生長期。將該菌懸液以1：100～1：50轉接于20ml LB液體培養基中，37℃振蕩擴大培養，當培養液開始出現混濁后，每隔20～30min測一次OD600nm，至OD600nm≤0.5時停止培養；

（2） 取培養液1.5ml轉入微量離心管中，在冰上冷卻10min，于4℃，5000r／min離心10min（從這一步開始，所有操作均在冰上進行，速度盡量快而穩）。

（3） 倒凈上清培養液，用1ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液輕輕懸浮細胞，冰浴，0～4℃，5000r／min離心10min；

（4） 棄去上清液，加入500μl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心懸浮細胞。0～4℃，5000r／min離心10min；

（5） 棄去上清液，加入100μl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心懸浮細胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態細胞懸液；

（6） 制備好的感受態細胞懸液可直接用于轉化實驗，也可加入占總體積15％左右高壓滅菌過的甘油，混勻后在超凈工作臺分裝到Eppendorf微量離心管中，液氮速凍后，置于-70℃條件下，可保存半年至一年。