噬菌體抗體ELISA

噬菌體抗體ELISA

噬菌體ELISA快速而便捷，尤其是因為pⅧ有多拷貝會導致信號的擴增。不過，后續的抗體檢測總是要以其可溶性形式進行。

[器材和試劑]

● 96孔ELISA板，例如Nunc maxisorb442404(可自VWR購得)

● 2％M

● /Tween

● 辣根過氧化物酶(HRP)標記的小鼠抗噬菌體單克隆抗體(mAb)(Amer Sham BiOSCiences)

● 3，3’，5，5’—四甲基聯苯胺(TMB)液體底物系統(SigmaT—8665)

● 終止液(1mol/L H2SO4)

● 噬菌體樣品

[方法]

1．按每孔100ul蛋白抗原包被微量滴定板，4℃過夜。中10ug/m1的濃度是包被抗原的標準濃度。但有時需要更高的濃度或者不同的包被緩沖液(比如碳酸鹽緩沖液)。

2．棄去抗原液并用洗滌板孔2次。

3．加入200wl的2％M封閉板孔，37℃孵育2小時。

4．用洗滌板孔 3次。

5．每孔加入SOpl的4％M。

6．每孔加入50ul含噬菌體抗體的培養基上清，用移液器反復吹吸混勻，室溫孵育1小時。

7．棄去溶液，用/Tween洗滌板孔3次，再用洗滌3次。

8．將HRP標記的小鼠抗噬菌體單抗用2％M按照1：5000稀釋后，每孔加入100ul；室溫孵育1小時。

9．棄去二抗，并用/Tween和分別洗滌3次。

10．每孔加入100ul TMB系統溶液，并在暗處室溫孵育10～30分鐘。數分鐘內，應呈現藍色。

11．每孔加入50～100ul終止液，終止反應。

12．在450nm處讀板。

除了用噬菌體(粒)進行ELISA外，也可以用可溶性片段。在噬菌粒展示載體上抗體片段的表達受控于1acZ啟動子。在無葡萄糖的條件下，可以終止1acZ啟動子的代謝抑制作用，而它卻可為IPTG所誘導。抗體片段的表達是以一種被動方式滲漏到上清中(部分原因是其對大腸桿菌所產生的毒性)的。應當注意的是，有些抗體片段，例如那些毒性不很大的抗體在外周質中滯留的蛋白(甚至過夜培養后)比上清中所存在的要多些。

本處所述方法取決于起始培養基中可代謝的葡萄糖量(0．1％)在誘導劑(1PTG)加入時要足夠低。這可以避開所有的離心步驟并降低污染的風險。