免疫組化技術典型實驗案例學習2

7、我做了兩張切片：一張用老試劑盒內還剩下一點的血清而另一張用新試劑盒內的封閉血清，其余試劑（二抗、SP）均用新試劑盒提供的，結果是前一張效果很好，而后一張能夠看到特異性染色，但背景太深，拍照效果不佳。--看來封閉血清也是罪會禍首之一。

結果分析顯示：抗體稀釋液的PH值偏低和封閉血清的失效導致了我的免疫組化結果的不佳，望大家在以后的組化實驗中也要注意這兩個不太引人注意的關鍵問題。--慘痛的教訓，值得引以為鑒。

案例二：DAB染色后切片著色呈陰性結果

背景：其實免疫組化在DAB染色后一般有四種情況：陽性染色效果很好、陰性染色、非特異性染色很深、陰陽臉（染色不均勻）。而陰性染色是許多初學者經常遇到的頭疼問題。我身邊有個研究生同學在我們實驗室初次涉入免疫組化，聽說步驟不難，跟我后面做了幾次之后，就自己開始做了，連續做了三次，結果均是陰性染色。很掃興，不知是什么原因導致的。

問題及其解答：免疫組化染色呈陰性結果的原因有哪些？

1、抗體濃度和質量問題以及抗體來源選擇錯誤。不知抗體是進口的還是國產的工作液，怎么這么高稀釋度也沒能做出陽性結果？另外，不是抗體濃度越高就越易出現陽性結果，抗原抗體反應有前帶和后帶效應，必須摸索最佳濃度。

2、抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位，以利于與抗體結合；建議微波修復用高火4次*6min試試。有人做過實驗，這是最佳的時間和次數。若不行，還可高壓修復。

3、組織切片本身這種抗原含量低；

4、血清封閉時間過長。

5、DAB孵育時間過短。

6、細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內參與反應。

7、開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。

我的實際解決方案：

1、首先，排除組織切片內的抗原有無丟失及其含量多少。免疫組化中兩個最重要的因素是抗原和抗體。（1）抗原有無丟失主要看組織切片的新鮮程度，一般切片室溫保存超過3-6個月，可能切片內的抗原丟失很嚴重（有文獻支持），此時可以通過重新用石蠟塊切片來進一步驗證（蠟塊需要低溫保存）。（2）石蠟切片在制作過程中可能因醛基對抗原決定族的封閉，這需要通過抗原修復來充分暴露，從而增加抗原抗體結合反應，提高陽性率，我一般用6min*4次中火微波抗原修復，用枸櫞酸鈉緩沖液。（3）組織切片中本身抗原含量的多少？這方面我有教訓的，我做胎鼠睪丸間質細胞鑒定，用1：200一抗效果很好；但我用 1：200一抗孵育成年睪丸間質細胞檢測，幾乎呈陰性，后來證實是因為兩者抗原含量相差甚遠，則一抗也要適當提高濃度。

2、其次，檢查抗體有無選擇錯誤和抗體孵育條件是否不適。（1）一抗選擇單克隆抗體易出現陰性結果，因為靈敏度低但特異性好；一抗的species reactivity中無檢測組織的種屬，這是比較常見的錯誤；一抗選擇rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出現陰性結果。（2）抗體孵育時間過短，容易導致陰性結果。一般一抗我建議4度孵育過夜和37度復溫45min；二抗我一般37度30min。我不喜歡參照二抗染色試劑盒說明書。（3）抗體濃度過低。這是陰性結果的最可能原因。必須提高稀釋度，我一般初次做一種新抗體，喜歡先用說明書建議的低濃度和高濃度做一次，然后決定是向高還是低方向摸索。一般先決定二抗的濃度（工作液就好辦了，直接滴加），重點摸索一抗的最適濃度。注意：免疫反應中存在前帶和后帶效應，這提示不是濃度越高，陽性率就越高，反之亦然。（4）重要原因排除之后，也不要忽視抗體的質量：原裝抗體一般比較穩定，效果較好；而進口分裝次之；工作液可能要注意質量問題。

3、同時，DAB的孵育時間可能要適當延長，在鏡下觀察，有時可延長至30min。但一般3-10min最好，此時背景也較淺。否則，說明抗體濃度不合適。

4、最后，血清封閉時間也可相應縮短。一般10-30min，但這個時間可以調整，封閉主要是降低切片的總體背景著色。

5、此外，細胞通透也不可忽視。許多戰友認為石蠟切片一般不需細胞通透，因為切片時可能已經把細胞切開了，但對于胞核蛋白，建議還是通透一下，促進抗體等試劑充分進入參與反應。