（1） 有限稀釋法
材料：
a、96孔細胞培養板等；
b、HT培養基；
c、活力強的雜交瘤細胞；
d、小鼠腹腔細胞。
方法：
a、制備小鼠腹腔細胞。同“細胞融合”一節中的方法。
b、制備待克隆的雜交瘤細胞懸液，用含20%血清的HT培養基稀釋至每毫升含2.5、15和50個細胞3中不同的稀釋度。
c、按每毫升加入5×104-1×105細胞的比例，在上述雜交瘤細胞懸液中分別加入腹腔巨噬細胞。
d、每種雜交瘤細胞分裝96孔板一塊，每個稀釋度32孔，每孔量為0.2ml，每孔的雜交瘤細胞數分別為0.5、3和10。
e、37℃、7.5% CO2濕潤培養7-10天，出現肉眼可見的克隆即可檢測抗體；在倒置顯微鏡下觀察，標出只有單個克隆生長的孔，取上清作抗體檢測。
f、取抗體檢測陽性孔的細胞擴大培養，并凍存。
g、本法中（b）、（c）、（d）也可簡化為將計數后的雜交瘤細胞準確地進行系列稀釋，直至每毫升含10個細胞，按每孔接種0.1ml細胞懸液，即每孔含1個細胞。
（2）軟瓊脂法
材料：
a、HT培養基（雙倍濃度）。
b、用0.15mol/L NaCl配制的2.0%瓊脂糖：稱取2.0g細胞培養用瓊脂糖，懸浮于100ml 0.15mol/L NaCl，121℃高壓滅菌15分鐘，分裝10ml小瓶，冷卻后4℃保存。
c、小鼠腹腔細胞。
d、滅菌平皿。
e、45℃水浴。
f、活力很好的雜交瘤細胞。
方法：
a、在培養皿中制備飼養細胞（小鼠腹腔細胞）單層。
b、臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養液混勻，配成1%瓊脂糖培養液，45℃水浴中溫育。
c、吸去平皿上層培養液，加入1%瓊脂糖培養液3ml，室溫10分鐘。
d、取雜交瘤細胞懸液1ml，加入1%瓊脂糖培養液1ml混勻，鋪于上層。
e、37℃、7.5%濕潤培養7-14天；克隆生長至2mm時，用毛細吸管吸出克隆，直接轉種于含有飼養細胞的24孔板，擴大培養。
f、吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續克隆化，或擴大培養、凍存。
5、雜交瘤細胞的凍存與復蘇
（1）雜交瘤細胞的凍存
在建立雜交瘤細胞的過程中，有時一次融合產生很多“陽性”孔，來不及對所有的雜交瘤細胞作進一步的工作，需要把其中一部分細胞凍存起來；另一方面，為了防止實驗室可能發生的意外事故，如停電、污染、培養箱的溫度或CO2控制器失靈等給正在建立中的雜交瘤帶來災難，通常盡可能早地凍存一部分細胞作為種子，以免遭到不測。在雜交瘤細胞建立以后，更需要凍存一大批，以備今后隨時取用。
細胞凍存的原理是細胞在加血清和二甲基亞砜的培養基中以一定的緩慢速度下降溫度（0℃?? -20℃，每分鐘下降1℃；-20℃??
-40℃每分鐘下降2℃），可在-196℃液氮或液氮蒸氣中長期保存。下面介紹我們實驗室的細胞凍存方法，經幾年來對多種細胞的使用，細胞復蘇存活率均在
80%以上。
①材料：
a、帶蓋吸管筒一只（鋁質或洋鐵皮制），內壁（包括筒底和蓋）襯1-2層石棉紙或石棉布。
b、含10-20%血清、5-10% DMSO的HT培養基，冰浴降溫至0℃左右（用作凍存液）。
c、滅菌安瓶或帶蓋小瓶。
d、-70℃冰箱。
e、液氮及液氮罐。
f、處于對數生長中期、健康而活力好的雜交瘤細胞。
②方法：
a、將雜交瘤細胞（或其他細胞）離心，重新懸浮于預冷的凍存液中，濃度為106-107左右/ml，分裝安瓶，每瓶1ml，置冰浴上；安瓶上標明細胞名稱、凍存日期、批號等。
b、安瓶封口后仍置冰浴上。
c、將安瓶放入一帶收口繩的小布袋內，布袋上標明凍存號、細胞名稱等，立即將布袋放入吸管筒內，置-70℃冰箱。
d、2-4小時后或過夜后從-70℃冰箱取出吸管筒，將盛有細胞的布袋移入液氮罐；在布袋的線繩上作好標記或代碼；最后在液氮凍存簿上作詳細記錄。
e、液氮罐應定期補充液氮（最好是專人管理）；補充液氮及存取細胞時應帶保護眼鏡和手套，以免因液氮凍傷等