1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml，過濾消毒，4度保存。
2.細胞培養：取待測培養細胞，制備成細胞懸液，按等量接種入多孔培養板中，培養6小時左右開始加藥。
3.制備篩選培養基：在100ug/ml~1000ug/ml范圍內確定幾個梯度，比如先做個100ug/ml、400ug/ml、800ug /ml、1000ug/ml，按梯度濃度用培養基稀釋G418制成篩選培養基。
4.加G418篩選：吸除培養孔中培養基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養基。
5.換液：根據培養基的顏色和細胞生長情況，每3~5天更換一次篩選培養基。方法同4.
6.確定最佳篩選濃度：在篩選10~14天內能夠殺死所有細胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。在第一輪就篩選出最佳G418濃度的可能性不大，最有可能的是出現這種情況：用某一濃度G418的量在篩選14天后還不能殺死細胞，而用下一個梯度的
G418的量在10天前就看不到活細胞了。假如是400ug/ml不能殺死細胞，而800ug/ml在第5天就把所有細胞都殺死了，則可以再用500ug
/ml、600ug/ml、700ug/ml進一步篩選，以確定最佳篩選濃度！心得：由于特性明確的細胞系G418的最佳用量還是比較穩定的，所以有時候不需要在這么大范圍內進行篩選。比如說你要轉染NIH3T3細胞，現在我告訴你我測試過NIH3T3細胞對G418的敏感性，我用的篩選濃度是200
ug/ml，這時你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三個濃度進行篩選。
通過預實驗確定了最佳篩選濃度后，就可以做穩定轉染了。
a 轉染：轉染后培養24小時或者更長，到細胞增長接近匯合時按1:4密度傳代，繼續培養，待細胞密度增至50%~70%匯合時；
b 加G418：去掉培養液，PBS洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的G418篩選培養基。
c 換液：根據培養基的顏色和細胞生長情況，每3~5天更換一次篩選培養基。當有大量細胞死亡時，可以把G418濃度減半維持篩選。 篩選10~14天后，可見有抗性的克隆出現，停藥培養，待其逐漸增大后；
d 挑單克隆：制備細胞懸液，細胞計數，用培養基稀釋細胞到1個/10ul。在96孔板中加入培養基150ul/孔，再加入細胞懸液10ul/孔。待其逐漸增大后轉入到48孔中增殖。
e 單克隆鑒定：細胞大量擴增后，提取總RNA,做RT-PCR檢測目的基因是否存在。
常見問題：
1.轉進去的重組質粒以什么形式存在于細胞內的？
無外乎兩種形式：整合在染色體中和存在于細胞質中。沒有經過篩選前大部分轉染進細胞的質粒是存在于胞質中的，但是這種質粒是不穩定的，基本上篩選不出這種單克隆，只有穩定整合入染色體的才是我們想要的穩定細胞系。
2.neo基因和目的基因是不是一定會整合在一起？
整合是隨機發生的非同源性重組，neo基因表達而目的基因不一定都表達，所以在篩選之后還要用RT-PCR的方法進一步鑒定。
培養基處理的個人技巧
體內的任何細胞被置于體外培養后，對環境都有一個適應過程，期間細胞對培養液具有同化作用，即細胞從培養液中攝取營養的同時，也向培養液排出自己的代謝產物和其它一些物質，其中有排泄物也有促細胞生長因子。這個過程也是細胞同化培養基的過程。細胞越多則其同化作用越強，所以細胞數目多比數目少較易生長。在篩選后期，大批細胞死亡，不換液沒有死亡的細胞就會受到死亡細胞的影響，換液后殘留的少量細胞對培養基的同化作用不強，也不利于生長。我是用適應性培養基來解決這一問題的：
適應性培養基的配制
a 培養同源細胞至半匯合狀態時，更換一次培養液，再繼續培養24~48小時后，吸出所有培養液
b 離心：3000~4000rpm 10 min后，吸取上清液
c 濾過：再經直徑0.22um濾器過濾，再加入2倍體積的新鮮培養基，低溫凍存備用。