細胞工程（cellengineering）技術介紹

廣義的細胞工程（cell engineering）指所有應用于生物學和醫學的、以細胞為操作對象的技術手段，其中也包括細胞培養。一般地說，細胞工程主要指應用各種手段對細胞不同結構層次(整體、細胞器、核、基因等)進行改造，如進行細胞融合、核移植、基因轉移等，以獲得具有特定生物學特性的細胞。

一．細胞融合技術
在細胞自然生長情況下，或在其他人為添加因素存在下，使同種細胞之間或不同種類細胞之間相互融合的過程，即為細胞融合（cell fusion）。通過細胞融合，可將來源于不同細胞核的染色體結合到同一個核內，結果形成一個合核體的雜種細胞。
細胞在生長過程中，可能發生自發的融合，但幾率很低。在實際工作中常采用各種促融合手段，包括病毒類融合劑如仙臺病毒、化學融合劑如聚乙二醇（PEG）及電激融合法等。在進行細胞融合反應和適當時間的培養后，需要通過一定方法對兩種親本細胞融合產生的具有增殖能力的雜種細胞進行篩選。篩選方法主要包括藥物抗性篩選、營養缺陷篩選和溫度敏感性篩選等。

細胞融合最典型的應用是單克隆抗體技術。細胞融合技術的發展和骨髓瘤細胞株的建成促成了B細胞雜交瘤技術的建立和單克隆抗體技術的成功。
1975年Koehler和Milstein將用綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞和體外培養能長期繁殖的小鼠骨髓瘤細胞融合，獲得了具有兩種親本細胞特性的雜交細胞，即既能在培養條件下長期生長增殖，又能分泌特異的抗綿羊紅細胞的抗體的B淋巴細胞雜交瘤。對這種融合細胞進行克隆化以后，即可獲得來自同一細胞克隆的抗體，這種抗體具有高度的均一性，稱為單克隆抗體。

二．核移植技術
細胞核移植（nuclear transfer）是指將一個雙倍體的細胞核（可來自胚胎細胞或體細胞）移植到去核的成熟卵母細胞或受精卵中。重組的卵細胞可以植入母體，并能發育為與供核細胞基因型相同的后代，因此又稱為動物克隆技術。1997年誕生的克隆羊“多利”就是體細胞核移植技術的產物。
核移植技術首先是選取合適的受體去核卵細胞和供體核。將獲得的核轉移到已經人工去核的成熟卵母細胞卵周隙后，施加微電流脈沖，使核質融合，形成一個重組卵。重組卵需經一定時間的體外培養，或放入中間受體動物輸卵管內孵育，經過一段時間的培養，有的動物需形成桑椹胚或囊胚，再植入受體子宮里。

實際上，胚胎細胞核移植技術的應用已有半個世紀的歷史，德國科學家Spemann于1938年最先提出并進行了兩棲類動物細胞核移植試驗。中國學者童第周于1963年在世界上首次報道了將金魚等魚的囊胚細胞核移入去核未受精卵內，獲得了正常的胚胎和幼魚。
體細胞核移植也在上世紀六十年代在非洲爪蟾獲得成功。1997年英國羅斯林研究所Wilmut首次報道以高度分化的成年母羊乳腺細胞為核供體克隆出小羊“多利”。“多利”的誕生在理論上具有重要意義，說明高等動物高度分化的成體動物細胞核仍具有發育的全能性。目前，通過體細胞核移植獲得的“克隆鼠”、“克隆牛”等均已面世。

三． 基因轉移技術
基因轉移（gene transfer）指向受體細胞中導入外源基因，是改造細胞遺傳性狀的常用手段。一般情況下，能穩定接納外源基因的細胞只有受體細胞總數的千分之幾。因此為了快速有效地篩選轉化細胞，一般在轉入基因中攜帶有特定的選擇標記，目前應用較多的為細胞抗藥性篩選，如根據新霉素抗性基因進行篩選。基因轉移又常稱為基因轉染（gene transfection）。
1． 物理學方法 包括電穿孔、顯微注射、裸露DNA直接注射。
電穿孔法利用脈沖電場提高細胞膜的通透性，在細胞膜上形成納米大小的微孔，使外源DNA轉移到細胞中。該方法較為簡單，廣泛應用于培養細胞的基因轉移。
顯微注射法主要用于制備轉基因動物。該法的基本操作程序是：通過激素療法使雌鼠超數排卵，并與雄性小鼠交配，然后從雌鼠輸卵管內取出受精卵；借助于顯微鏡將純化的DNA溶液迅速注入受精卵中變大的雄性原核內；將注射了基因的受精卵移植到假孕母鼠輸卵管中，繁殖產生轉基因小鼠。該方法轉入的基因隨機整合在染色體DNA上，有時會導致轉基因動物基因組的重排、易位、缺失或點突變。

裸露DNA直接注射法是最簡單的基因轉移方法。將裸露DNA直接注射到組織后，DNA有可能直接被細胞所攝入。外源基因進入細胞的效率與局部組織或細胞的損傷程度有關，基因在體內的表達時間與機體的免疫功能有關。
2．化學方法 基因轉移的化學方法包括DEAE－葡聚糖、磷酸鈣沉淀、脂質體法等，是通過增加細胞膜的通透性、增加胞吞或胞飲、增加DNA與細胞的吸附等機理而實現基因轉移的。這些方法多用于培養細胞的基因轉移。
DEAE－葡聚糖法將外源DNA片段與DEAE－葡聚糖等高分子碳水化合物混合，形成的含DNA的大顆粒黏附于受體細胞表面，通過其胞飲作用進入細胞內。這種方法的轉染效率較低。磷酸鈣共沉淀法是使待轉化的DNA與磷酸鈣共沉淀形成大顆粒，顆粒懸液與細胞一起孵育，顆粒通過胞飲作用進入細胞。該方法轉染效率至少是DEAE－葡聚糖法的100倍。脂質體（lipofectin）法令脂質體試劑與DNA作用將DNA分子包入其囊狀結構中，攜帶了DNA的脂質體可與受體細胞膜發生融合，DNA片段隨即進入細胞質和細胞核內。該方法基因轉移效率很高。

3．生物學方法
基因轉移的生物學方法主要指病毒介導的基因轉移。根據受體細胞類型的不同，可選擇使用具有不同宿主范圍和不同感染途徑的病毒基因組作為轉染載體。目前常用的病毒載體包括DNA病毒載體（腺病毒載體、猴腫瘤病毒載體、牛痘病毒載體）、反轉錄病毒載體等。用作基因轉導的病毒載體都是缺陷型的病毒，感染細胞后僅能將基因組轉入細胞，無法產生包裝的病毒顆粒。這種方法的缺點是：所有的病毒載體都會誘導產生一定程度的免疫反應；都或多或少地存在一定的安全隱患；而且轉導能力有限、不適于大規模生產。