活體電穿孔法介紹2

電　壓

電穿孔時在能量導入一定的情況下設計施加電壓的值。電壓過低或過高都會影響外源基因的表達。電壓過低時，無法造成細胞膜表面狀態的改變，因而外源D 不能進入細胞內。電壓過高時，局部組織積聚過多熱量，造成細胞的死亡或組織失去功能，即使外源基因導入細胞，也無法進行正常的表達。哺乳動物常用的活體電壓大多為20～100VPcm ，最高電壓在250～750VPcm。

電穿孔次數和時間

有試驗證明，皮膚的電阻在每一次電穿孔后都有所降低，說明電穿孔使皮下組織形成孔道，且其大小隨電穿孔而變大，經過電穿孔的處理后外源基因更易在更深的真皮和毛囊內表達。但電穿孔次數不能過多，否則會對局部的細胞組織造成不可逆的損害，基本應在10 次以內，

每組電穿孔時間應在20～100msec 。

能量的測算

電穿孔過程中能量的測算公式為: Q(J ) = V2 TP412R 其中Q 代表電穿孔時導入的能量，V 代表施加的電壓，T 代表電穿孔延續的時間，R 代表作用組織的電阻。試驗證明在導入能量一定的情況下外源基因轉移效率也相近。在此原則基礎上可根據不同的組織器官選擇不同的電壓和電穿孔時間。

溫　度

由于電穿孔瞬間在局部會產生大量熱，因此操作過程中，DNA 轉染試劑應保持4 ℃，同時電穿孔操作部位的溫度也應適當降低，Muramatsu 證明溫度較低的情況下，外源基因的轉移表達效率會有明顯的提高。此外在電穿孔操作部位溫度降低的同時可以有效抑制局部組織的出血和外源DNA 的流失，這樣也在一定程度上保證了基因的導入效率。

DNA 的狀態和濃度

很多試驗都證明線狀DNA 較環狀DNA 在活體電穿孔法瞬時表達系統的建立中效果較好[12 ] 。DNA 的濃度應在1～40mgPml 范圍內。

DNA 溶液組分

DNA溶液中不應含有不能分解成離子的組分，如甘露糖醇、蔗糖等。這些大分子存在時會降低基因的轉移效率。

5、活體電穿孔法在不同組織上的應用

肌肉組織

在肌肉組織中最初進行外源基因活體導入是采用電穿孔法。選擇肌肉組織作為靶組織是因為肌肉組織在體內所占比例很大，約占40 % ，而且外源基因可在肌肉中長期表達、分泌，在基因治療中經常會用到。此外，外源基因也不會因肌細胞的分裂而丟失。

皮　膚

皮膚組織相對于其他組織較難進行電穿孔法的基因導入，因為皮膚比較薄，電阻相對低，要求電流較高。但如果電流過大，會嚴重影響基因的表達，因此應適當降低電流和電壓，延長電穿孔的時間。另外，由于皮膚組織含有的脂肪細胞分布不均，會干擾電穿孔的作用，因此只推薦用鑷狀電極，且應將動物被毛刮凈后操作。雖然外源基因在皮膚中表達的時間較肌肉中短，但可利用活體電穿孔法對很多皮膚疾病進行治療。