過氧化物酶標記測定法檢測細胞凋亡

原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產生很強的顏色反應，特異準確的定位出正在凋亡的細胞，因而可在普通光學顯微鏡下進行觀察。
毛地黃植物是地高辛的唯一來源。在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結合的配體，因而非特異性反應很低。抗地高辛的特異性抗體與脊椎動物甾體激素的交叉反應不到1%,若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細胞Fc受體非特異性的吸附作用。
本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養的或從組織中分離的細胞凋亡測定。
（一）試劑配制
1、磷酸緩沖液PBS（pH7.4）：磷酸鈉鹽 50mM，NaCl 200mM。
2、蛋白酶K（200μg/ml,pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。
3、含2%H2O2的PBS緩沖液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS緩沖液 98.0ml。
4、TdT酶緩沖液（新鮮配）：Trlzma堿 3.63g用 0.1N HCl調節pH至 7.2，加ddH2O定容到 1000ml；再加入二甲砷酸鈉 29.96g和氯化鈷0.238g。
5、TdT酶反應液：TdT酶32μl；TdT酶緩沖液 76μl，混勻，置于冰上備用。
6、洗滌與終止反應緩沖液：氯化鈉 17. 4g；檸檬酸鈉 8.82g；ddH2O 1000ml
7、0.05%二氨基聯苯（DAB）溶液：DAB 5mg;PBS 10ml，pH7.4， 臨用前過濾后，加過氧化氫至0.02%。
8、0.5%甲基綠（pH4.0）：甲基綠0.5g；0.1M乙酸鈉100ml。
9、100%丁醇，100%、95%、90%、80%和70%乙醇，二甲苯，10%中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。
10、 過氧化物酶標記的抗地高辛抗體（ONCOR）
（二）實驗步驟
1、標本預處理：
（1）石蠟包埋的組織切片預處理：將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min。用無水乙醇洗兩次，每次3min。用95%和75%乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug/ml），于室溫水解15min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2min，然后按下述步驟2進行操作。
（2）冰凍組織切片預處理：將冰凍組織切片置10%中性甲醛中，于室溫固定10min后，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min.置乙醇：乙酸（2:1）的溶液中，于-20℃處理5min,去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進行操作。

（3）培養的或從組織分離的細胞的預處理：將約 5 × 107個/ml細胞于 4%中性甲醛室溫中固定 10min。在載玻片上滴加 50~100μl細胞懸液并使之干燥。用PBS洗兩次，每次5min,然后按下述步驟2進行操作。
2、色缸中加入含2%過氧化氫的PBS，于室溫反應5min。用PBS洗兩次，每次5min。
3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1~5min。
4、用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應液，置濕盒中于37C反應 1hr（注意：陰性染色對照，加不含TdT酶的反應液）。
5、將切片置于染色缸中，加入已預熱到37℃的洗滌與終止反應緩沖液，于37℃保溫30min,每10min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動。

6、組織切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應30min.
7、用PBS洗4次，每次5min。
8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05%DAB溶液，室溫顯色3~6min.
9、用蒸餾水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。
10、于室溫用甲基綠進行復染10min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最后1次靜置30s.依同樣方法再用100%正丁醇洗三次。
11、 用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、干燥后，在光學顯微鏡下觀察并記錄實驗結果。
（三）注意事項
一定要設立陽性和陰性細胞對照。陽性對照的切片可使用DNaseI部分降解的標本，陽性細胞對照可使用地塞米松（1μM）處理3-4hr的大、小鼠胸腺細胞或人外周血淋巴細胞。陰性對照不加TdT酶，其余步驟與實驗組相同。