實驗概要
將某種蛋白注射新西蘭大耳兔產生免疫反應，通過ELISA檢測免疫產生的抗體。
實驗原理
將抗原吸附在固相載體表面，加入抗血清，抗體和抗原在載體表面形成抗原-抗體復合物，洗去未結合抗體，然后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（抗體的抗體），二抗與抗體結合，洗去未結合二抗，加底物顯色劑顯色，在一定波長下測定 OD 值，根據 OD 值判斷血清中抗體的產生情況。
主要試劑
PBS 緩沖液
弗氏完全佐劑
弗氏不完全佐劑
碳酸鹽緩沖液
辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG 二抗稀釋液
TMB 底物溶液 A 液與 B 液
主要設備
研缽
注射器
兔固定架
錐形瓶
酶聯板
洗板機
酶標儀
實驗材料
新西蘭大耳兔（公）
實驗步驟
1. 抗原的乳化
以無菌 PBS 緩沖液溶解抗原，使總蛋白的濃度為 2 mg/mL，將弗氏完全佐劑與抗原溶液以 1∶1 比例混合，在干凈無菌的研缽內研磨，直至形成穩定的油包水型乳劑（一小滴乳劑在水面上不擴散）。
2. 初次免疫
(1) 獲得陰性血清
免疫前，耳緣靜脈采血約 2 mL。置 37℃ 1 h，4℃靜置過夜使血清析出，離心（2000 r/min，4℃，10 min），吸取上清，分裝后 -80℃保存。
(2) 注射
用弗氏完全佐劑乳化的抗原溶液，在兔背部、大腿處進行皮內、肌肉多點注射。皮內注射：每處約 0.1 mL，共注射 20-30處；肌肉注射：每點 1 mL，兩點注射。注射完畢，輕輕按摩注射部位以幫助吸收，注射位置出現白色小皮丘。
3. 加強免疫
一周后，用弗氏不完全佐劑乳化的抗原進行加強免疫，過程同初次免疫。每隔一周，以 PBS溶解的抗原（總蛋白濃度為 2 mg/mL）加強免疫一次。
免疫 4 次后，間接 ELISA 法測定抗血清效價上升情況。
4. 抗血清的制備
(1) 血清中抗體的效價上升且達到穩定值后，加強免疫一次，一星期后可采血獲得大量抗血清；
(2) 采血前保證飲水，但停食一天，以降低血脂；
(3) 將大耳兔用兔固定架固定；
(4) 心臟采血，采血后的注射器需靜置，以免發生溶血現象；
(5) 將采得血液 37℃靜置 1 h，4℃過夜，離心（3000 r/min，4℃，10 min），吸取上清，分裝為不同體積，-80℃保存備用。
5. 間接 ELISA 測定
(1) 以包被液（碳酸鹽緩沖液）包被抗原溶液，使對應抗原終濃度為 0.5 μg/mL；
(2) 在酶聯板的每孔中加入 100 μL 抗原包被液，處理及對照包括：
抗原包被液＋一抗＋二抗
抗原包被液＋二抗
輕輕振動平板使抗原分布均勻，將包被的微量滴定板用塑料保鮮膜封好，37℃潮濕孵育 60 min，再置 4℃過夜；加有抗原溶液的微量滴定板封好后于 4℃可保存數月。
(3) 次日，在洗板機上用 PBST 洗滌三次；
(4) 每孔加入 150 μL~200 μ L封閉液，37℃潮濕孵育 60 min；
(5) 倒掉封閉液，用 PBST 洗滌三次，最后每塊滴定板用一大紙巾包裹，孔口朝下，在幾張紙巾上輕輕拍打，棄去殘余的液體；
(6) 用稀釋液將抗血清做 1∶20、1∶40、1∶80、1∶160 稀釋，取 100 μL 分別加入到對應包被孔中，微量滴定板用塑料保鮮膜封好，37℃潮濕孵育 60 min；
(7) 洗板機上用 PBST 洗滌三次，最后一次洗滌后，如步驟 5 所述棄去殘余液體；
(8) 每孔中加入 100 μL 辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG 二抗稀釋液（1∶10000 稀釋），37℃潮濕孵育 60 min，洗滌三次；
(9) 混合 TMB 底物溶液 A 液與 B 液，每孔加入 50 μL，37℃顯色 15~30 min；
(10) 每孔中加入 50 μL 2 mol/L H2SO4 終止反應；
(11) 酶標儀上測定 OD450 值。