細胞NADPH氧化酶活性化學發光法定量檢測試劑盒

細胞NADPH 氧化酶活性化學發光法定量檢測試劑是一種旨在使用化學發光分子光澤精受
到NADPH 氧化酶催化產生的超氧陰離子O2-的還原，然后在其還原過程中釋放能量，由此
測定樣品中特異性氧化還原酶（oxidoreductase）的活性，即采用發光探測儀（Luminometer）
測定其相對冷光單位（RLU）的變化，以此進行測算酶活性的而經典的技術方法。該技
術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細胞樣品（動物或人體）還原
型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH 氧化酶）的特異活性檢測。用于免疫、血液
研究、蛋白組學、病理生理學等研究。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作
簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。
技術背景
NADPH 氧化酶，通常稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide
adenine dinucleotide phosphate oxidase；NADPH oxidase；EC1.6.3.1）或還原型輔酶II 氧化酶，
是機體防御機制中的重要元素。NADPH 氧化酶由6 個亞體構成：Rho GTP 酶（Rho guanosine
triphosphatase）和5 個phox（吞噬細胞氧化酶；phagocytic oxidase）。其中主要包含細胞膜
嵌合蛋白質分子（gp91phox、p22phox、flavocytochrome b558 等），以及位在細胞質內的蛋
白質分子（p47phox、p67phox、p40phox、Rac1、Rac2 等）。其zui特征性的酶活性是超氧化
物歧化酶敏感的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶。細胞膜上的NADPH 氧化酶被激
活，將還原型輔酶Ⅱ（NADPH）轉變為氧化型輔酶Ⅱ（NADP），氧分子則獲得電子形成超
氧陰離子O2-，由O2-又可生成H2O2 和OH－。其超氧陰離子產物具有殺死微生物的功能。
NADPH 氧化酶異常將導致慢性肉芽腫病（Chronic Granulomatous Disease；CGD）。基于底
物NADPH，受到NADPH 氧化酶的催化作用，產生超氧陰離子O2-，進而超氧陰離子將化
學發光分子光澤精（lucigenin）還原，并釋放能量，通過發光探測儀（Luminometer）檢測，
來測定NADPH 氧化酶的活性。其反應方式為：
產品內容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
反應液（Reagent D） 毫升
陰性液（Reagent E） 毫升
底物液（Reagent F） 微升
專性液（Reagent G） 微升
說明書1 份
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；反應
液（Reagent D）和底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6 月
用戶自備
15 毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
1.5 毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
微型臺式離心機：用于樣品制備
細胞刮脫棒：用于細胞脫離
恒溫培養箱或恒溫水槽：用于反應物孵育
專用測定杯：用于冷光測定的容器
化學發光儀：用于冷光分析
實驗步驟
測讀開始前，打開化學發光儀，設定儀器內溫度為30℃預熱和運行程序（清洗步驟等），然
后關掉實驗室的燈光。將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；反應液
（Reagent D）和底物液（Reagent F）注意避光。然后進行下列操作。
一、樣品準備
1. 準備好25cm2 細胞培養瓶或60mm 細胞培養皿的待測培養細胞（1 至5 X 106 細胞）
2. 小心加入xx 毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
5. 加入xx 毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
6. 移入到預冷的15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
7. 放進4℃臺式離心機離心5 分鐘，速度為300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx 微升裂解液（Reagent B），充分混勻
10. 轉移到預冷的1.5 毫升離心管
11. 強力渦旋震蕩15 秒
12. 置于冰槽里孵育30 分鐘
13. 放進4℃微型臺式離心機離心5 分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14. 小心移取xx 微升上清液到新的預冷的1.5 毫升離心管，置于冰槽里——此為細胞總蛋白
15. 同時加入xx 微升裂解液（Reagent B）到顆粒管
16. 即刻放進預冷的DOUNCE 勻漿器
17. 在冰槽里用研磨棒勻化組織顆粒（約80 下）
18. 轉移到到另一個新的預冷的1.5 毫升離心管——此為細胞膜蛋白
19. 分別移取10 微升進行蛋白定量檢測
20. 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作
二、測定準備
1． 從-70℃取出上述制備的待測樣品，置于冰槽里（注意：檢測前樣品須澄清；參見注意
事項7）
2． 設定好化學發光儀（溫度為30℃）：整合10 秒，間隔1 分鐘，測定15 分鐘，并置零（注
意：參見注意事項9）
三、背景對照測定（選擇步驟）
1． 移取xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的專用測定杯
2． 加入xx 微升反應液（Reagent D）
3． 加入xx 微升陰性液（Reagent E）
4． 放進30℃培養箱里孵育3 分鐘
5． 加入xx 微升底物液（Reagent F）
6． 上下傾倒數次，混勻（限定在3 秒之內）
7． 即刻放進化學發光儀里
8． 整合10 秒，測讀15 分鐘，獲得RLU（RELATIVE LIGHT UNIT）讀數，此為背景空對
照
四、樣品總活性測定
1． 移取xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的專用測定杯
2． 加入xx 微升反應液（Reagent D）
3． 加入xx 微升待測樣品（注意：300 微克細胞膜蛋白和100 微克細胞總蛋白；樣品須溶
解；參見注意事項7）
4． 放進30℃培養箱里靜置3 分鐘
5． 加入xx 微升底物液（Reagent F）
6． 上下傾倒數次，混勻（限定在3 秒之內）
7． 即刻放進化學發光儀里，
8． 整合10 秒，測讀15 分鐘，獲得RLU（RELATIVE LIGHT UNIT）讀數，此為樣品總活
性
五、樣品特異活性測定（選擇步驟）
1． 移取xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的專用測定杯
2． 加入xx 微升反應液（Reagent D）
3． 加入xxx 微升專性液（Reagent G）
4． 加入100 微升待測樣品（注意：300 微克細胞膜蛋白和100 微克細胞總蛋白；樣品須溶
解；參見注意事項7）
5． 放進30℃培養箱里靜置3 分鐘
6． 加入xx 微升底物液（Reagent F）
7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3 秒之內）
8． 即刻放進化學發光儀里
9． 整合10 秒，測讀15 分鐘，獲得RLU（RELATIVE LIGHT UNIT）讀數，此為樣品特異
活性
六、樣品活性分析
1．計算公式
x
2．繪制RLU 讀數（Y 軸）和時間（X 軸）關系曲線
注意事項
1． 本產品為21 次（10 個樣本）操作，包括1 次背景對照測定
2． 操作時，須戴手套
3． 反應液（Reagent D）和底物液（Reagent F）注意避光
4． 測讀的所有步驟均須在暗室里進行
5． 系統操作過程中，背景測定只需1 次
6． 背景測定和總活性測定可以省略
7． 樣品檢測前，須溶解和澄清
8． 加入底物液（Reagent F）后3 秒內即刻測定
9． 反應測定值隨著時間增加而逐漸升高，通常15 分鐘達到峰值，并趨于穩定；測定持續
15 分鐘
10．測定值由低到高變化，表明有酶活性
11．測定后，專用測定杯須清洗徹底
12．建議待測樣本總蛋白濃度為500 微克/100 微升（300 微克膜蛋白+200 微克總蛋白）或
純化細胞膜蛋白為300 微克/100 微升；如果樣本酶活性過低，則可以增加樣本量
13．如果檢測純化細胞膜蛋白的酶活性，可以加入花生四烯酸（Arachidonic Acid）激活處
理
14．樣品實際活性是指超氧化物歧化酶敏感的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，去
除其它干擾因素