液相色譜（HPLC）入門（二）

什么是色譜圖?

色譜圖表示發生在高效液相色譜系統中的化學[色譜]分離。一系列從基線出現的峰以時間為坐標。每個峰代表對不同化合物的檢測器反應。色譜圖由計算機數據站描繪。[如圖 H].

Figure H: How Peaks Are Created

圖H中，黃色譜帶完全通過了檢測器流通池；產生的電信號被送到計算機數據站。得到的色譜圖逐漸出現在屏幕上。請注意從進樣開始，色譜圖就在屏幕底部形成直線。這條直線稱為基線，它代表隨時間變化，純流動相通過流通池。隨著黃色分析物譜帶穿過流通池，一個較強信號被傳送到計算機。這條曲線，開始是上升，之后下降，和樣品譜帶中的黃色染料的濃度成正比。這就形成了色譜峰。當黃色譜帶完全流出檢測器的流通池，信號強度回到基線水平，而流通池現在又一次，只有流動相。由于黃色譜帶流動最快，首先從色譜柱洗脫出來，所以這是第一個峰。之后，一個紅色譜帶到達流通池。從紅色譜帶進入流通池開始，信號從基線抬起來，代表紅色譜帶的色譜峰被劃出來。在本圖中，紅色譜帶還沒有完全通過流通池。圖中所示是如果我們此刻停止該過程，紅色譜帶和紅色色譜峰的樣子。由于紅色譜帶的大部分已經通過了流通池，色譜峰的大部分已經被劃出來，如實線所示。如果我們能再開始，紅色譜帶能完全通過流通池[虛線]。最強保留的藍色譜帶流速最低，在紅色譜帶之后流出。虛線表示如果我們連續完成，一個完整的色譜圖如何出現。有意思的是藍色峰的寬度將是最寬的，而藍色分析物譜帶的寬度在柱子上、是最窄的，而從柱中流出時變得最寬。這是因為它在色譜柱填料床中移動較慢，需要較多時間[和流動相體積]才被完全洗脫出來。由于流動相在一個固定的速度下移動，這意味著藍色譜帶展寬和變稀。由于檢測器的反應與譜帶的濃度成正比，因此藍色峰高較低，而寬度較大。

定性和定量化合物

圖H中，三個時間上分開的色譜峰代表三個染料化合物。每一個洗脫物在一個特定的位置，時間段計算從進樣[零時]到峰最高點洗脫出來為止。比較每個峰的保留時間[tR]和注入同一色譜系統的標準物質[相同流動相和固定相]的保留時間，色譜工作者就可能鑒定每一個化合物。

圖 I -1 中出示的色譜圖，色譜學家已經知道，在設定的液相條件下，分析物丙烯酰胺可以被分離并在2.85分鐘[保留時間]從柱中洗脫下來。當任何一個新樣品含有丙烯酰胺時，在相同的液相條件下，都會在2.85分鐘出現色譜峰[如圖 I -2 種樣品 B]。當鑒定完成后，下一個重要的信息是樣品中每一個化合物的含量是多少。來自檢測器的色譜圖和相應數據幫助我們計算每種化合物的濃度。檢測器基本上反映化合物譜帶通過流通池的濃度。濃度越高，信號越強，這可從基線上色譜峰高度觀察到。

Figure I-2: Identification and Quantitation

圖 I-2中，樣品A和B的色譜圖，在同一時間段相互重疊。兩個樣品的進樣體積是一樣的。兩張色譜圖在保留時間[tR] 2.85 分鐘時都出現了一個色譜峰，表明每個樣品都含有丙烯酰胺。然而，樣品A顯示出一個明顯變大的丙烯酰胺峰。峰下面的面積[峰面積計算]是測量化合物濃度的一種方法。峰面積數值是由計算機數據站自動積分和計算。在這個例子中，樣品A中丙烯酰胺的峰面積是樣品 B 中的十倍。利用標準樣品對比，可以推斷樣品 A 含有 10 pg 丙烯酰胺，是樣品 B 中丙烯酰胺含量的十倍[1 pg]。注意另外一個峰[沒有鑒定] 在兩個樣品中的洗脫時間都是 1.8 分鐘。由于峰面積在兩個樣品中大致相同，因此這個未知化合物可能在兩個樣品中含量相同。

等度和梯度液相系統操作

高效液相色譜使用兩種基本的洗脫模式。第一種稱為等度洗脫。在這種模式下，流動相，無論是純溶劑或混合物，在整個操作過程中保持不變。一個典型的系統如圖J-1所示。

第二種稱為梯度洗脫，正如名稱所指，流動相的組成在分離過程中發生變化。這種模式對含有多種不同色譜極性化合物的樣品非常有用[參見"高效液相色譜分離模式"]。隨著分離的進行，流動相的洗脫強度逐漸增強以洗脫出更強保留的樣品組分。

最簡單的一個例子，如圖 J-2 所示，有兩個溶劑瓶和兩個泵。每個泵的流速由梯度控制器管理，在分離過程中傳輸或多或少的溶劑。兩種溶劑在混合器中混勻形成實際流動相，再傳輸到色譜柱上。起始階段，流動相含有大比例的弱溶劑[溶劑 A]。一段時間以后，強溶劑[溶劑 B]的比例增加。注意圖 J-2中，混合器是兩個泵的下游，因此，梯度是在高壓下產生的。另一種高效液相色譜系統可設計為在泵前低壓條件下混合多種溶劑。一個梯度比例閥從四個溶劑瓶之間選擇溶劑，隨時間改變流動相強度[如圖 J -3]。