高效液相色譜量級 [分析，制備和工程]
我們已經討論了高效液相色譜如何提供分析數據，用于定性和定量樣品中的化合物。然而，高效液相色譜也可以用來純化和收集所需的每一個化合物，在流通池下游使用組分收集器。這個過程被稱為制備液相[如圖 K].
在制備液相中，科學家可以收集每個流出色譜柱的組分[例如：在本例中，黃色，之后紅色，之后藍色]。圖 K: 高效液相色譜系統用于純化：制備色譜法餾分收集器在特定的時間段，選擇收集純化了的組分。收集瓶可移動，從而使每瓶只收集單個峰的組分。科學家確定純化的程度和數量的目標。結合樣品的復雜性，所需組分相對基質的性質和相濃度等考慮，這些目標，又決定了需要處理的樣品量和高效液相色譜系統的處理量。總的來說，隨著樣品量的增加，高效液相色譜柱尺寸將會加大，泵也會需要更高的體積流速。決定一個高效液相色譜系統的處理量稱為選擇高效液相色譜的量級。 表 A 列出各種高效液相色譜的量級及其色譜分離目標。
通過特定地匹配HPLC的固定相和流動相來最大化選擇性-即獲得兩組分的最大分離度-在決定一個分離過程所需時很關鍵[參考"討論高效液相色譜分離模式"]。容量成為衡量匹配上樣量的柱體積[Vc]和選擇適當顆粒[決定壓力和效率，參考分離能力的討論]的關鍵。柱體積，填料床長度[L]和內徑[i.d.]，決定填料多少。(如圖 L).
Figure L: HPLC Column Dimensions
總的來說，高效液相色譜柱長度[L]在 20 毫米到500 毫米之間，內徑[i.d.]在 1 毫米到100 毫米之間。隨著色譜量級的增加，柱尺寸增加，橫截面積增加。為了優化通量，流動相流速必須與橫截面積成比例增加。如果較小的顆粒要獲得更強分離能力，泵必須設計成能承受更高反壓下的更高流動相體積、流速。表 B 列出一些簡單的挑選準則，為每種色譜量級推薦的色譜柱直徑和顆粒尺寸范圍。
例如，半制備級液相[紅色 X]可以用內徑10 -40 毫米裝 5 -15 微米的顆粒。柱長度可根據需要純化的化合物的量和要求分離的程度計算出來。當你放大分離處理量時，沃特世制備計算器軟件 CD 可以幫你恰當地選擇色譜柱和設定其他操作參數，如流速。
高效液相色譜柱硬件
一個色譜柱管路和配件必須填有決定分離效果的色譜柱填料[固定相]。它必須能夠承受生產過程和使用中的反壓。而且，它必須是樣品入口和分離的譜帶出口控制良好[無泄漏，最小體積和零死體積]的流路，而且相對于分離系統[樣品，流動相和固定相]來說具有化學惰性。為承受盡可能高的壓力，大多數色譜柱由不銹鋼制成。當分析特殊化學品或生物制品需要惰性表面材料時，也可能會用到盡管只能承受較小壓力的 PEEKTM [一種工程塑料] 和玻璃[圖 M-1]。
玻璃制色譜柱壁有視覺優勢。在圖 M - 2 的照片中，當樣品譜帶還在色譜柱中，傳輸被停止。你可以看到樣品混合物中的三種染料已經在床層中分開，黃色分析物移動最快，將要流出色譜柱。
圖 M-2: 色譜柱內部
分離性能 - 分離度
兩種化合物分離的程度稱為色譜分離度[RS]。 由色譜柱決定的總體分離能力或分離度的兩個主要的因素是，機械分離能力：由色譜柱長度，粒徑和填料床層的均一性決定，和化學分離能力：由填料和流動相對化合物的物化競爭決定。效率是衡量機械分離能力的指標，選擇性是化學分離能力的指標。
機械分離能力 - 效率
如果色譜柱床穩定均一地填充，它的分離能力就由柱長度和顆粒大小決定。機械分離能力，也叫效率，通常以塔板數[符號是N]來測量和比較。較小顆粒色譜床有較高效率和反壓。對于固定的顆粒大小，增加色譜柱長度可獲得更強的機械分離能力。然而，代價是色譜運行時間延長，更多溶劑消耗和更高反壓。減少色譜柱長度可以減小以上變量但也降低了機械分離能力，如圖 N 所示。
圖 N: 色譜柱長度和機械分離能力 [相同顆粒尺寸]
圖 O: 粒徑和機械分離能力 [相同色譜柱長度]
化學分離能力 - 選擇性
選擇一種顆粒化學[固定相]和流動相的組合－－分離系統－－將決定化學分離能力[我們改變每一種分析物的速度的方法]的程度。優化選擇性是創造分離最強有力的方式，這樣可避免對最高機械效率的無盡追求。要產生對任何兩種化合物的分離，科學家需在多種條件的相組合[固定相和流動相]中和保留機制[色譜模式]中選擇。