1.技術背景
米酵菌酸（Bongkrekic acid，BA）是由椰毒假單胞菌屬酵米面亞種產生的一種可以引起食物中毒的呼吸系統性毒素。其結構如下圖所示，它是一種脂溶性酸性化合物，主要產生于谷類發酵制品、變質椰子食品及鮮銀耳類產品中，攝入受其污染的食物會引發中毒，嚴重可致死亡。
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目前市面上常用方法以及國標規定方法為固相萃取柱凈化和液液萃取的凈化方法，可能會面臨操作復雜、有機試劑消耗大、干擾多、回收率低等問題，Pribolab技術研發中心基于現有的標準方法的不足和局限性，建立了多功能凈化柱“一步法”凈化，可用于液相色譜二極管陣列檢測器或液相色譜串聯質譜檢測食品中的米酵菌酸殘留，具有前處理簡單快速、環保低有機試劑消耗、回收率高，凈化效果好的特點，適用于各類食品基質中米酵菌酸的測定。
2.實驗方法
參考食品安全國家標準-食品中米酵菌酸的測定（GB 5009.189-2016），優化前處理方法，使其適用于“一步法”快速高效凈化。
2.1實驗試劑耗材
Pribolab? 500μg/mL米酵菌酸標準物質（乙腈）
Pribolab?·ODS·C18 液相色譜柱
PriboFast? MFC 335多功能凈化柱
PriboFast玻璃纖維濾紙
乙腈水提取液：量取84 mL乙腈用水定容至100 mL，混勻備用。
2.2樣品制備與提取
干試樣經粉碎過篩，濕試樣經充分均質，稱取25.0g試樣置于錐形瓶中，加入100mL乙腈水提取液，混勻，超聲提取30min，5000 r/min離心5分鐘或用玻璃纖維濾紙過濾，待凈化。
2.3試樣的凈化
取8mL上清液加入透明玻璃管中，使液體通過PriboFast? 335多功能凈化柱完成凈化。取凈化后的溶液過濾膜后上液相或液質分析。
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3.液相液質條件
液相色譜條件
液相質譜條件
色譜柱：Pribolab真菌毒素專用色譜柱C18(4.6*250 mm,5 μm)
Pribolab真菌毒素專用色譜柱C18（2.1*100 mm,1.8 μm）
流動相：甲醇+水（1%乙酸）=80:20
0.1%甲酸水-乙腈梯度洗脫
柱溫：30℃
30℃
進樣量：20μL
1μL
流速：1ml/min
0.3μL/min
檢測器：267nm
ESI-MRM，負離子模式
4.實驗結果
4.1實驗譜圖
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圖1 米酵菌酸液相色譜圖
圖2米酵菌酸液質TIC圖
4.2結果分析
米酵菌酸結構式含有3個羧基（-COOH），酸性較強，容易丟失質子而帶上負電荷，其保留因子和選擇性受pH值影響大，當流動相條件為酸性時可避免離子化從而得到對稱色譜峰。因此液相色譜采用甲醇+1%乙酸水（80:20）為流動相，分離效果好，方法檢出限為0.2μg/g。在液質檢測中0.1%甲酸水-乙腈為流動相，同樣酸性環境抑制了米酵菌酸的電離，使其以分子形式存在，在反向固定相中的保留增強，且減少了與固定相中殘存硅醇基的結合，有助于改善峰型，方法檢出限0.1μg/kg。
本次實驗選取了常被米酵菌酸污染的食品酸湯子、米粉、銀耳進行加標實驗驗證，加標水平2 mg/kg,每種加標做6個平行。結果如下表所示。
米粉
銀耳
酸湯子
平均回收率(%)
88.77
92.46
83.41
相對標準偏差（%）
3.8
2.4
3.1
5.結論
本實驗建立多功能凈化柱“一步法”凈化食品中的米酵菌酸，具有前處理簡單高效，回收率高的特點，適用于液相以及液質方法檢測米酵菌酸殘留，對食品風險監測和相關標準的制定具有指導意義。
實驗耗材采購指南
貨號
名稱
規格
STD#8050
Pribolab?500 μg/mL米酵菌酸(Bongkrekic Acid)/乙腈
1.2mL
MSS1084
pribolab?米酵菌酸（Bongkrekic Acid)
0.5/1.0mg
EH04072
Pribolab? ODS C18 液相色譜柱
4.6mm*150mm 5um
EH04073
Pribolab? ODS C18 液相色譜柱
4.6mm*250mm 5um
M3005
PriboFast?MFC335固相凈化柱
5mL
GF/A-100
PriboFast 玻璃纖維濾紙